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Jain, Dhawal (2015): Effects of nucleosome remodeling factor ACF1 on in vivo chromatin organization. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

Eukaryotic genomes make use of nucleosomes to considerably reduce their packaging volumes. As a consequence, the underlying DNA is rendered inaccessible. Cells make use of ATP-dependent remodeling factors to disrupt histone-DNA contacts and bring about access to the DNA. ACF1 is the largest regulatory subunit of two nucleosome remodeling factors, namely ACF and CHRAC. These complexes assemble, slide or evenly space nucleosomes on DNA with an ability to sense the linker lengths. However, roles of ACF1 in organizing nucleosomes in vivo and their physiological consequences are largely unclear. To understand the roles of ACF1 on chromatin organization, I compared nucleosome occupancy and transcription profiles in wild-type and ACF1-deficient Drosophila embryos. To further investigate and corroborate these chromatin changes, I performed genomewide mapping of ACF1 using chromatin immunoprecipitation. Nucleosome occupancy was mapped by subjecting DNA obtained from MNase-digested chromatin to deep sequencing and the occupancies were analyzed using advanced analog signal processing methods. We found discontinuous and discrete patches of regularly positioned nucleosomes in wild-type tissue, referred to as ‘regularity regions’. These regions span actively transcribing and silent chromatin domains and show associated variation in the linker lengths across them. A subset of these regions located at sides remote from the transcriptional start sites loses regularity upon ACF1 deletion and show presence of a novel DNA sequence motif. Analyzing nucleosome periodicity by autocorrelation function revealed that nucleosome linker length is longer in ACF1-deficient embryos. Despite profound quantifiable changes in the chromatin organization the RNA expression analyses did not show any major changes. Genomewide localization of ACF1 was studied using by chromatin immunoprecipitation. We observed a strong enrichment of ACF1 along active promoter regions, coinciding strikingly well with another remodeling factor, RSF-1. However, careful analyses using mutant tissues for both proteins demonstrated that the observed enrichments were in fact false positive. We define 3100 genomic sites as false positive ‘Phantom Peaks’ that tend to enrich in the ChIP-seq experiments. By comparing publicly accessible profiles and the Phantom regions, we showed that several ChIP-seq profiles of the epigenetic regulators show strong enrichment along the Phantom Peaks. In conclusion, we identify regions of regularly organized nucleosomes across the genome and show that a subset localized in silent chromatin regions is affected by ACF1 deletion. Moreover, we identified a class of false positive ChIP-seq peaks at active promoters. This list of Phantom Peaks can be used to assess potential false positive signal in a ChIP-seq profile, especially when mutant tissue is not available as a control.

Abstract

Eukaryoten nutzen Nukleosomen um das Packvolumen ihres Genoms drastisch zu reduzieren. Dadurch wird die Zugänglichkeit der DNA stark eingeschränkt. Um bei Bedarf DNA-Abschnitte von Nukleosomen zu lösen nutzen eukaryotische Zellen ATP-abhängige Remodeling Faktoren. Zwei dieser Remodeling Faktoren, ACF und CHRAC, sind Multiproteinkomplexe und beinhalten als grösste Untereinheit das Protein ACF1. Beide Komplexe können Nukleosomen assemblieren, verschieben und mit gleichmässigen Abständen auf einem DNA-Strang anordnen. Es ist aber noch weitgehend unbekannt, was die genauen Funktionen dieser Komplexe in der lebenden Zelle sind, und wie sie dort die Nukleosomenorganisation beeinflussen. Um diese Fragen zu beantworten habe ich Nukleosomenverteilungen und Transkriptionsprofile in normalen und ACF1-mutanten Drosophilaembryonen bestimmt. Zusätzlich habe ich mit Hilfe der Chromatin-Immunopräzipitations-Methode (ChIP) untersucht, wo auf dem Genome ACF1 bindet. Die Nuklesomenverteilung wurde bestimmt, indem Embryonenchromatin mit MNase verdaut wurde, und die resultierenden DNA-Fragmente sequenziert wurden. Dabei haben wir herausgefunden, dass es verschiedene Regionen auf dem Genom mit sehr gleichmässig angeordneten Nukleosomen gibt. Wir nennen diese Regionen “regularity regions”. Sie sind sowohl in transkribiertem wie auch inaktivem Chromatin zu finden und haben unterschiedliche Nukleosomenlinkerlängen. Viele dieser regulären Regionen sind nur in normalen, aber nicht in ACF1-mutanten Embryonen zu finden. Diese ACF1-abhängigen regulären Chromatinabschnitte zeigen auch bislang unbekanntes DNA Motiv. Indem die Nukleosomenperiodizität mit einer Autokorrelationsfunktion bestimmt wurde, konnte gezeigt werden, dass der Nukleosomenlinker in ACF1-mutanten Embryonen länger als normal ist. Obwohl klare Defekte in der Chromatinorganisation in ACF1 Mutanten gefunden wurden, zeigte eine RNA-Expressionsanalyse keine grösseren Unterschiede zu normalen Embryonen. Die genomweite Verteilung von ACF1 wurde mit der ChIP-Methode untersucht. Wir haben dabei eine starke Anreicherung von ACF1 an aktiven Promotoren gefunden, sehr ähnlich wie beim verwandten Remodeling Faktor RSF-1. Nachdem wir aber die Experimente in ACF1 und RSF-1 mutanten Embryonen wiederholt hatten, und die Lokalisierung beider Faktoren an Promotoren immer noch zu sehen war, schlossen wir daraus, dass die beobachteten Anreicherungen falsch-positiv waren. Insgesamt haben wir in unseren ChIP-Experimenten an 3100 Stellen des Genoms falsch-positive “Phantom Peaks” gefunden. Indem wir verschiedene öffentlich zugängliche ChIP-Profile mit diesen “Phantom Peaks” verglichen haben, konnten wir zeigen, dass mehrere dieser Profile ein grosse Übereinstimmung mit den “Phantom Peaks” hatten. Wir haben also einerseits innerhalb des Fliegengenoms Regionen mit sehr gleichmässig angeordneten Nukleosomen gefunden und gezeigt, dass ein Teil davon die Regularität in der Absenz von ACF1 verliert. Darüberhinaus haben wir eine Klasse von falsch-positiven ChIP-Anreicherungen an aktiven Promotoren identifiziert: Diese Liste von “Phantom Peaks” kann nun dazu benutzt werden, potentiell falsch-positive Signale in ChIP-Experimenten zu identifizieren, vor allem wenn keine Kontrolle mit einer Nullmutante durchgeführt werden kann.