Untersuchungen zu Bacillus cereus Enterotoxin-Komplexen auf zellulärer Ebene

Wegscheider, Monika (2004): Untersuchungen zu Bacillus cereus Enterotoxin-Komplexen auf zellulärer Ebene. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

This paper deals with the in vitro activity of the B. cereus enterotoxin-complexes Hemolysin BL (HBL) and non-hemolytic enterotoxin (Nhe) on cells. For that purpose the cytotoxic and hemolytic activity of crude B. cereus culture supernatants was analyzed in cell culture assays and on blood agar plates. Specific monoclonal antibodies were used for the detection of single components. By using neutralisation assays and subtractive immoaffinity chromatography the inactivation of the specific toxin complexes could be achieved. When testing different cell lines (Vero-, Neuro2A-, Jurkat-, hybridoma cells) for their sensibility against culture supernatants of toxic B. cereus isolates, Vero cells proved to be the most sensitive. The sensitivity pattern of hybridoma cells differed from the other cell lines, as HBL containing supernatants showed higher cytotoxicity than supernatants of single Nhe-producers. Analyses of 18 B. cereus isolates revealed that the 5 - 40 % of the cytotoxic activity measurable in culture supernatants could be attributed to HBL. A strong correlation (r2 = 0,938) could be found between remaining cytotoxic activity and the detectable L2 concentrations. The results of the neutralisation assays could be verified by subtractive immunoaffinity chromatography of Nhe B and testing the Nhe B negative, HBL positive B. cereus culture supernatants (Nhe B-/HBL+). Furthermore it could be demonstrated for the first time that Nhe B plays a major part in the appearance of the discontinuous hemolytic pattern typical for HBL producers. After sensibilisation with tunicamycin Vero cells showed a substantial increased cytotoxic activity (63 – 132 %). The same effect could be observed in Fumonisin B pretreated cells for crude supernatants, but not for the Nhe B-/HBL+ preparation. Neither treatment with swainsonine, castanospermine nor enzymatic treatment with sialidase and N-glycosidase F resulted in an alteration of toxicity.

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der in vitro Aktivität der B. cereus Enterotoxin-Komplexe Hämolysin BL (HBL) und Non-Hemolytic Enterotoxin (Nhe) auf zellulärer Ebene. Dazu wurden die zytotoxische und hämolytische Aktivität ungereinigter Kulturüberstände von B. cereus in Zellkultur und auf Blutplatte überprüft. Der Nachweis der einzelnen Toxin-Komponenten erfolgte mittels spezifischer monoklonaler Antikörper (mAk). Die gezielte Inaktivierung der Toxinkomplexe in ungereinigten B. cereus Kulturüberständen wurde mittels Neutralisation bzw. subtraktiver Immunaffinitätschromatographie erreicht. Bei der Überprüfung der Sensitivität verschiedener Zelllinien von Vero-, Neuro2A-, Jurkat- und Hybridom-Zellen gegen toxinhaltige B. cereus Kulturüberstände erwiesen sich Vero-Zellen als die sensitivste Zelllinie. Hybridom-Zellen zeigten im Gegensatz zu den übrigen Zelllinien ein verändertes Sensitivitätsmuster insofern als HBL-haltige Überstände höhere Toxizitäten zeigten als Überstände reiner Nhe Produzenten. Bei der Untersuchung von 18 B. cereus Isolaten zeigte sich, dass HBL für 5 – 40 % der in den Kulturüberständen nachweisba-re zytotoxischen Aktivität verantwortlich ist. Es bestand eine hohe Korrelation (r2 = 0,938) mit den nachweisbaren L2-Antigentitern. Die Ergebnisse aus den Neutralisationsversuchen konnten mittels subtraktiver Immunaffinitätschromatographie (IAC) von Nhe B und den so gewonnenen Nhe B negativen Kulturüberständen von HBL-Produzenten (Nhe B-/HBL+) bestätigt werden. Außerdem konnte demonstriert werden, dass Nhe B bei der Entstehung der für HBL-Produzenten typischen diskontinuierlichen Hämolyse eine wichtige Rolle spielt, was bislang unbekannt war. Die Sensibilisierung von Zellen mit Tunicamycin führte bei HBL- und Nhe-haltigen Überständen zu einer Steigerung der zytotoxischen Aktivität von 63 - 132%. Ebenfalls eine Steigerung konnte bei einer Fumonisin B1 Vorbehandlung beobachtet werden. Mit Nhe B-/HBL+-haltigen Überständen wurde dieser Effekt jedoch nicht erzielt. Weder die Behandlung der Zellen mit Swainsonin, Castanospermin noch die enzymatische Behandlung mit Sialidase und N-Glykosidase F resultierte in einer Änderung der Toxizität.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Bacillus cereus, Enterotoxine, Wirkungsweise
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. Februar 2004