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Strütt, Eva (2015): Detektion und Differenzierung von Hämogregarinen im Blut von Importreptilien mit Hilfe molekularbiologischer Methoden (Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzierung). Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Hemogregarines are protozoan blood parasites, belonging to the phylum Apicomplexa. They have a life cycle which includes two or three hosts. The merogony and gamogony takes place in the reptile host and the sporogony takes place in an invertebrate host. Therefore reptiles always represent intermediate hosts, while invertebrates act as definitive hosts. In reptiles, the genera Haemogregarina, Hepatozoon, Karyolysus and Hemolivia have been described including about 400 different species in reptiles. Most of the genera and species have been described based only on morphological characteristics and the reptilian host species. However, usefulness of these features for genus or species diagnosis is currently under debate. The parasite stages that are located in the erythrocytes of reptiles can, however, very often not be distinguished by their morphology. In the present study, therefore, a molecular biological approach was chosen to distinguish the hemogregarines from blood samples of reptiles, which were recently imported to Germany. Blood samples, which had been previously found to contain hemogregarines by microscopical investigation, were included in the investigation. As a target sequence the 18S rRNA gene was chosen. Using three different primer pairs HEMO1/HEMO2 (Perkins and Keller, 2001), HepF300/Hep900 (Ujvari et al., 2004) and A mod / 18AP1488.R (Medlin et al., 1988; Wozniak et al., 1994). PCR amplification was performed and phylogenetic analyses were based on the sequences obtained directly from the PCR amplification products. Blood samples from 13 ball pythons (Python regius), 23 emerald tree boas (Corallus caninus), seven African mud turtles (Pelusios castaneus) and one tokay gecko (Gekko gecko) were analysed. Three sequences from ball pythons, nine different sequences from emerald tree boas, and two sequences from African mud turtles could be obtained. Only one of these sequences was completely identical with one of the sequences available at the NCBI genbank originating from a Hepatozoon sp. from an elegant sand racer (Psammophis elegans). The remaining sequences thus seem to be first molecular description and characterisations of hemogregarines.In a phylogenetic tree the sequences obtained from the snakes clustered with Hepatozoon sp. but formed several separated groups indicating the existence of several species. The sequences obtained from parasites of the African mud turtles formed a sister clade to Haemogregarina sp. but were also close to species described as Hepatozoon sp. The formation of this clade was not supported by high bootstrap values. The taxonomic position thus seems to be unsolved. The present study shows that a variety of hemogregrine species have been introduced into Germany via imported reptiles. Using molecular methods most hemogregarines detected here were unequivocally characterized for the first time. Since the exact identification is fundamental for determination of pathogenicity of these hemogregarines in reptiles and for the development of a therapy, this study represents an important prerequisite for future investigations.

Abstract

Hämogregarinen sind einzellige Blutparasiten, die dem Stamm Apikomplexa angehören. Sie haben einen zwei- bis dreiwirtigen Entwicklungszyklus. Dabei findet im Reptilienwirt die Merogonie und Gamogonie und in einem Invertebraten die Sporogonie statt. Reptilien bilden daher den Zwischenwirt der Parasiten, während Invertebraten als Endwirte fungieren. Bei Reptilien wurden die Gattungen Haemogregarina, Hepatozoon, Karyolysus und Hemolivia und hier etwa 400 Arten beschrieben. Die Gattungs- und Artzuordnung erfolgte häufig aufgrund morphologischer Eigenschaften der intraerythrozytären Stadien unter Einbeziehung der Wirbeltierart. Die Eignung dieser Parameter für eine Gattungsund Artdiagnose ist allerdings umstritten, da sich die Parasitenstadien, die sich in den Erythrozyten der Reptilien befinden anhand ihrer Morphologie nur schwer unterscheiden lassen. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit ein molekularbiologischer Ansatz zur Differenzierung der Hämogregarinen aus Blutproben von frisch nach Deutschland importierten Reptilien gewählt. Als Zielsequenz wurde das 18S rRNA-Gen ausgewählt. Es wurden drei verschiedene, der Literatur entnommene, hämogregarinenspezifische Primerpaare verwendet (HEMO1/HEMO2 (Perkins und Keller, 2001), HepF300/Hep900 (Ujvari et al., 2004) und A mod/ 18AP1488R (Medlin et al., 1988; Wozniak et al., 1994)). In die Untersuchung einbezogen wurden Blutproben aus 13 Königspythons (Python regius), 23 grünen Hundskopfschlingern (Corallus caninus), sieben westafrikanischen Klappbrust-Pelomedusenschildkröten (Pelusios castaneus) und einem Tokeh (Gekko gecko). Drei partielle 18S rDNA-Sequenzen aus Python regius, neun Sequenzen aus Corallus caninus und zwei Sequenzen aus Pelusios castaneus wurden in die Sequenzanalysen einbezogen. Nur eine aus einem Königspython erhaltene Sequenz konnte einer bereits in der NCBI-Genbank vorhandenen Sequenz zugeordnet werden, und zwar einer Hepatozoon sp. aus einer Sandrennnatter. Alle anderen erhaltenen Sequenzen unterschieden sich von bereits in der Genbank vorhandenen Sequenzen, so dass keine eindeutige Artzuordnung möglich war und es sich offensichtlich um bisher nicht molekularbiologisch beschriebene Arten handelt.Die aus den Schlangen (Python regius und Corallus caninus) erhaltenen Sequenzen ordneten sich in einem phylogenetischen Stammbaum innerhalb der Gattung Hepatozoon sp. ein, bildeten dort aber unterschiedliche Gruppen, so dass das Vorkommen unterschiedlicher Arten gefolgert wurde. Die beiden Sequenzen aus den westafrikanischen Klappbrust-Pelomedusenschildkröten bildeten eine der Gattung Haemogregarina benachbarte Gruppe, zeigten aber auch enge Verwandschaft mit Hepatozoon. Ihre taxonomische Einordnung konnte daher nicht eindeutig geklärt werden. Es konnte gezeigt werden, dass mit importierten Reptilien eine Vielzahl an Hämogregarinenspezies nach Deutschland eingeführt wurde, die molekularbiologisch charakterisiert wurden. Da die eindeutige Identifizierung dieser Parasiten eine Voraussetzung für Untersuchungen zur Pathogenität von Hämogregarinen bei Reptilien und zu ihrer Therapie darstellt, bilden die durchgeführten Untersuchungen eine wichtige Grundlage für entsprechende weiterführende Studien.