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Moritz, Benjamin (2015): Prevention and prediction of production instability of CHO-K1 cell lines by the examination of epigenetic mechanisms. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

The CHO-K1 cell line is the most common expression system for therapeutic proteins in the pharmaceutical industry. Due to the nature of economics, the cell lines and the vector design are subject to constant change to increase product quality and quantity. During the cultivation, the production cell lines are susceptible to decreasing productivity over time. Often the loss of production can be associated with a reduction of copy number and the silencing of transgenes. During cell line development, the most promising cell lines are cultivated in large batch culture. Consequently, the loss of a stable production cell line can be very cost-intensive. For this reason I developed different strategies to avoid a reduced productivity. Instability of production cell lines can be predicted by the degree of CpG methylation of the driving promoter. Considering that the DNA methylation is at the end of an epigenetic cascade and associated with the maintenance of the repressive state, I investigated the upstream signals of histone modifications with the assumption to obtain a higher predictive power of production instability. For this reason I performed a chromatin immunoprecipitation of the histone modifications H3K9me3 and H3K27me3 as repressive signals and H3ac as well as H3K4me3 as active marks. The accumulations of those signals were measured close to the hCMV-MIE at the beginning of the cultivation and were then compared with the loss of productivity over two month. I found that the degree of the H3 acetylation (H3ac) correlated best with the production stability. Furthermore I was able to identify an H3ac threshold to exclude most of the unstable producers. In the second project I aimed to improve the vector design by considering epigenetic mechanisms. To this end I designed on the one hand a target-oriented histone acetyltransferase to enforce an open and active chromatin status at the transgene. On the other hand I point-mutated methylation-susceptible CpGs within the hCMV-MIE to impede the maintenance of inactive heterochromatin formation. Remarkably, the C to G mutation located 179 bp upstream of transcription start site resulted in very stable antibody producing cell lines. In addition, the examination of cell pools expressing eGFP showed that G-179 promoter variants were less prone to a general methylation and gene amplification, which illustrates the dominating effect in epigenetic mechanisms of one single CpG. The last project was performed to localize stable integration sites within the CHO-K1 genome. In so doing I could show that the transfection leads predominantly to integration into inactive regions. Furthermore I identified promising integration sites with a high potential to induce stable expression. However, those results are preliminary and must be viewed with caution. Further examination needs to be done to confirm these results. Considering the results of all three projects, I propose that the interplay of metabolic burden and selection pressure at an early time point of cultivation plays an important role in cell line development. Small alterations of selection pressure can lead to a decisive change of cell properties. Therefore, stable cells are less susceptible than weak producers. The increase of selection pressure leads to compensatory effect by gene amplification in the instable cell lines. The resulting adjustment of productivity masks the truly stable cells, which precludes the selection of the right cell lines. For this reason the selection pressure, the copy number as well as the growth rate should be considered to minimize repressive effects.

Abstract

Die CHO-K1 Zelllinie ist das am häufigsten verwendete Expressionssystem für therapeutische Proteine innerhalb der pharmazeutischen Industrie. Aus wirtschaftlichen Gründen wird die verwendete Zelllinie sowie die eingesetzten Vektoren ständig verbessert um die Produktqualität und -quantität zu erhöhen. Während der Kultivierungsphase neigen Produktionszelllinien dazu an Produktivität zu verlieren. Dabei wird der Produktivitätsverlust häufig mit einer Reduktion der Kopienzahl oder dem Silencing von Transgenen assoziiert. Während der Zelllinienentwicklung werden vielversprechende Zelllinien ausgewählt und im großen Ansatz kultiviert. Ein Produktivitätsverlust innerhalb solcher Zellen ist somit sehr kostenintensiv. Um diese Gefahr zu minimieren entwickelte ich unterschiedliche Stategien, welche darauf abzielen den Produktivitätsverlust zu vermeiden. Produktionsinstabilität konnte von unserer Gruppe schon anhand des CpG Methylierungsgrades am CMV Promoter vorhergesagt werden. Die DNA Methylierung wird wahrscheinlich zur Aufrechterhaltung eines inaktiven Chromatinstatus benötigt und steht am Ende einer epigentischen Kaskade. Im Gegensatz dazu erscheinen Histonmodifikationen früher in der Signalkaskade und könnten deswegen eine höhere Aussagekraft über die Stabilität haben. Aus diesem Grunde wurden von mir Histonemodifkationen am hCMV-MIE Promoter und Enhancer zu Beginn der Kultivierungsphase gemessen. H3K4me3, H3ac sind Histonmodifikationen die mit Expression assoziiert werden wohingegen H3K27me3 und H3K9me3 grundsätzlich mit einem inaktiven Chromatinstatus in Verbindung gebracht werden. Der Grad der unterschiedlichen Modifikationen wurde mit dem über zwei Monate entstehenden Produktivitätsverlust verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass der Grad der Histon H3 Acetylierung die höchste Korrelation mit der Stabilität aufwies. Des Weiteren konnte ich einen Grenzwert für die H3 Acetylierung definieren der einen Ausschluss der meisten instabilen Produktionszelllinien ermöglicht. Im zweiten Projekt wurde das Vector Design unter epigenetischen Aspekten verändert. Ich erstellte eine zielgerichtete Histonacetyltransferase, um in dem Chromatinbereich des Transgenes einen offenen und aktiven Status zu induzieren. Desweiteren mutierte ich methylierungsanfällige CpGs des hCMV-MIE Promoters und Enhancers um eine Methylierung und daraus folgend einen inaktiven Chromatinstatus zu verhindern. Die C zu G Konversion an dem 179 Basenpaar oberhalb der Transkriptionsstartstelle führte zu einer bemerkenswert stabilen Antikörperexpression in klonalen Zelllinien. Desweiteren konnte ich bei gleicher Promotervariante in eGFP exprimierenden Zellpools eine geringere Methylierung und Genamplifikation feststellen. Somit konnte zum ersten Mal die Effektsensitivität eines einzelnen CpGs verdeutlicht werden. Im letzten Projekt wurde die Expressionsstabilität abhängig von der Integrationsstelle des Transgenes untersucht. Dabei konnte ich zeigen, dass die standardmäßig durchgeführte zufällige Integration entweder bevorzugt in inaktiven Bereichen des Euchromatin stattfindet oder dass die Selektionsdruck induzierte Genamplifikation hauptsächlich im Heterochromatin stattfindet. Weiterhin vermute ich, dass beide Ereignisse hintereinander geschaltet sind, bei der die geringe Aktivität des Transgenes im inaktiven Euchromatin die Genamplifikation im Heterochromatin fördert. Bei der Untersuchung der Chromatinlandschaft und den enthaltenden Transgenen konnte ich vielversprechende aktive Regionen identifizieren, die wahrscheinlich die Stabilität der Expression fördern. Jedoch müssten diese Ergebnisse in weiteren Experimenten bestätigt werden. Bei der Betrachtung der drei Projekte zeigt sich, dass das Wechselspiel zwischen der Belastung des Stoffwechsels der Zelle und dem Selektionsdruck in der frühen Kultivierungsphase ausschlaggebend ist für deren weitere Entwicklung. Dabei können kleine Veränderungen des Selektionsdruckes die Zellen maßgebend beeinflussen. Stabil exprimierende Zellen sind dabei weniger angreifbar als schwach exprimierende Zellen. Bei einer Erhöhung des Selektionsdruckes kompensieren die schlechteren Produktionszelllinien ihren Nachteil durch Genamplifikation. Die Anpassung der Produktivität überdeckt die stabilen Zellen welches die richtige Auswahl erschwert. Aus diesem Grunde sollte der Selektiondruck, die Kopienzahl, sowie die Wachstumsrate in den Selektionskriterien mit einbezogen werden, um reprimierende Effekte zu minimieren.