Popp, Felix (2015): Molecular and behavioral analysis of magneto-aerotaxis in Magnetospirillum gryphiswaldense. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology |
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Abstract
Magnetotactic bacteria (MTB) contain nanometer-sized crystals of a magnetic iron mineral enabling directed swimming along geomagnetic field lines. However, although this unique behavior was discovered already 40 years ago, it still has remained poorly understood at the cellular level and the molecular mechanisms responsible for sensing environmental stimuli and transducing signals to the flagellar motors have been unknown. Therefore, the major goal of this thesis was to investigate the swimming behavior of Magnetospirillum gryphiswaldense both at the behavioral and molecular level. Individual motors of tethered M. gryphiswaldense cells were found to rotate both clockwise and counterclockwise with equal speed. Cells swam at speeds of up to 60 µm s-1 and commonly displayed runs of several hundred µm in length. In striking contrast to E. coli, which reorients the cell body between run intervals at random angles, motor switching events caused swimming reversals with reorientation angles close to 180°. The sensory repertoire of M. gryphiswaldense was analyzed by classical macroscopic chemotaxis assays, and aerotaxis was found to be the dominant behavior. In addition to the strong microaerophilic response in oxygen gradients, I observed tactic bands also under anoxic conditions within gradients of the alternative electron acceptor nitrate, suggesting that aerotaxis is part of a general redox or energy taxis mechanism. The aerotactic response of M. gryphiswaldense was furthermore analyzed by recording and tracking single cells under controlled atmospheric conditions in a gas perfusion chamber. Compared to other well-studied bacteria, M. gryphiswaldense displayed unusually low swimming reversal rates (<0.1 s-1) under equilibrium conditions. Abruptly shifting oxygen levels from 2% to 0% only slightly increased reversal rates, whereas a reverse shift from 0% to 2% caused a transient threefold increase in reversal rates that was directly followed by an extraordinarily sustained smooth-swimming phase without return to pre-stimulus levels. Apart from 56 putative genes encoding chemoreceptors that might be involved in magnetotaxis, four putative chemotaxis operons (cheOp1-4) were identified in the genome of M. gryphiswaldense, containing genes commonly involved in signal transduction from chemoreceptors to the flagellar motors. Single or combined deletions of cheOp2-4 did not have any pronounced effect on motility or aerotaxis. In striking contrast, deletion of cheOp1, which comprises only the canonical set of chemotaxis genes (cheAWYBR), caused individual cells to swim straight without reversing, resulting in a complete loss of aerotaxis. When analyzed under oxic conditions, most MTB possess a clear directional preference corresponding to downward movement in their natural habitat, referred to as “polar magneto-aerotaxis”. Although cultivated strains of magnetotactic spirilla were previously assumed to lack any directional preference, in this work polar swimming behavior could be restored in M. gryphiswaldense through repeated cultivation of cells in magnetic fields superimposed on oxygen gradients. Individual cells displayed a gradual bias of swimming runs with one of the cell poles leading that depended on ambient oxygen levels. In anoxic microdroplets, addition of 2% oxygen rapidly reversed the overall swimming direction of the entire population. However, in the absence of CheOp1 swimming polarity could be no longer selected and no reversal of swimming bias was observed. These findings for the first time show that there is a direct molecular link between aerotactic sensing and the determination of magnetotactic polarity, through the sensory pathway CheOp1. In a joint project in the last part of this thesis, I demonstrated how magnetotactic behavior can be manipulated through artificial recruitment of polarly localized CheW1-GFP fusion proteins to midcell anchors. GFP-labelled proteins were trapped by expressing GFP-binding nanobodies on the magnetosome membrane surface (referred to as “nanotrap”). By varying the expression level of the nanobody, a gradual knockdown of magneto-aerotaxis was achieved.
Abstract
Magnetotaktische Bakterien (MTB) enthalten wenige Nanometer große Kristalle magnetischer Eisenminerale, die ihnen die faszinierende Fähigkeit verleihen, sich entlang der Feldlinien des Erdmagnetfelds fortzubewegen. Obwohl diese besondere Form bakteriellen Schwimmverhaltens bereits vor nunmehr 4 Jahrzenten entdeckt wurde, ist das Verhalten einzelner Zellen, sowie die Mechanismen, die der Reizerkennung und Signaltransduktion zum Flagellenmotor zugrunde liegen, bis heute nur wenig erforscht. Das Ziel dieser Doktorarbeit war daher, die molekularen Grundlagen der Magnetotaxis im Modellorganismus Magnetospirillum gryphiswaldense zu charakterisieren und die Motilität einzelner Zellen detailliert zu untersuchen. Im ersten Teil meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass die Flagellenmotoren von M. gryphiswaldense jeweils mit gleicher Geschwindigkeit in beide Drehrichtungen rotieren und dadurch die Zellen auf bis zu 60 µm s-1 beschleunigen. Im Gegensatz zu E. coli, das während häufiger Taumelphasen seine Ausrichtung ändert, werden die oft mehrere hundert Mikrometer langen, geraden Schwimmepisoden von M. gryphiswaldense durch Umkehrvorgänge unterbrochen, die eine Änderung der Schwimmrichtung um ca. 180° bewirken. Bei der Untersuchung des allgemeinen chemotaktischen Verhaltens in makroskopischen Tests zeigte sich, dass die mikroaerophile Antwort von M. gryphiswaldense stark dominiert. Da unter Ausschluss von Sauerstoff zudem Bandenbildung in künstlich hergestellten Nitratgradienten beobachtet wurde, kann davon ausgegangen werden, dass das dominante aerotaktische Verhalten Teil einer umfassenderen Redox- oder Energietaxis ist. Die Aerotaxis von M. gryphiswaldense wurde anschließend unter kontrollierten atmosphärischen Bedingungen auf Einzelzellebene untersucht. Im Vergleich zu anderen gut erforschten Bakterien wurden unter Gleichgewichtsbedingungen nur relativ wenige Umkehrvorgänge registriert (<0.1 s-1), und ein abruptes Absenken des Sauerstoffgehalts von 2% auf 0% führte zu einer lediglich geringen Zunahme der Umkehrvorgänge. Nach einer plötzlichen Anhebung des Sauerstoffgehalts von 0% auf 2% stieg dagegen die Umkehrfrequenz kurzzeitig um das Dreifache an. Im Anschluss hieran wurden jedoch bemerkenswerterweise über lange Zeiträume fast keine Umkehrvorgänge registriert und selbst nach 80 s lag die Umkehrfrequenz unter dem Ausgangswert. In der genomischen Sequenz von M. gryphiswaldense wurden neben 56 Chemorezeptor-Genen insbesondere vier mutmaßliche Chemotaxisoperons (cheOp1-4) identifiziert. Während die Deletion von cheOp2-4(sowohl einzeln als auch in Kombination)keinen deutlichen Einfluss auf das Schwimmverhalten hatte, wurde nach Deletion von cheOp1 ein komplett nicht-aerotaktischer Phänotyp beobachtet, gekennzeichnet durch lange, ununterbrochene Schwimmepisoden. Unter sauerstoffgesättigten Bedingungen weisen die meisten MTB eine klare Richtungspräferenz auf, sogenanntes „polares Schwimmverhalten“. Obwohl den in Reinkultur verfügbaren Magnetospirillen diese Fähigkeit traditionell abgesprochen wurde, konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit durch wiederholte Kultivierung von M. gryphiswaldense in Sauerstoffgradienten, die von Magnetfeldern überlagert waren, polares Verhalten erzeugt werden. Die Mehrzahl der Zellen wies eine graduelle Bevorzugung einer Schwimmrichtung auf, die sich durch Variation des Sauerstoffgehalts beeinflussen ließ. Dies wurde durch Beobachtungen an zunächst anaerobisierten Zellpopulationen untermauert, die bei Zuführung von 2% Sauerstoff kollektiv ihre Vorzugsschwimmrichtung änderten. Nach Deletion von cheOp1 wurde im Gegensatz dazu keine Wiederherstellung der Schwimmpolarität beobachtet, was den Schluss nahe legt, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der durch cheOp1 kodierten Signaltransduktionskaskade und der molekularen Determination der magnetotaktischen Polarität existiert. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit konnte ich im Rahmen eines Kooperationsprojekt zeigen, wie durch Expression von GFP-bindenden nanobodies auf der Magnetosomenoberfläche die native Lokalisierung von GFP-markierten Signaltransduktionskomponenten künstlich verändert wird. Durch Variation der Kopienzahl des nanobodies wurde das CheW1-GFP Fusionsprotein in unterschiedlichem Umfang zur Zellmitte verschoben, was einen graduellen Ausfall der Magneto-Aerotaxis bewirkte.
Item Type: | Theses (Dissertation, LMU Munich) |
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Keywords: | magnetotaxis, motility, polarity, aerotaxis, signal transduction |
Subjects: | 500 Natural sciences and mathematics 500 Natural sciences and mathematics > 570 Life sciences |
Faculties: | Faculty of Biology |
Language: | English |
Date of oral examination: | 22. October 2015 |
1. Referee: | Schüler, Dirk |
MD5 Checksum of the PDF-file: | e3d8b6f4958edb314af6e3b90507ca59 |
Signature of the printed copy: | 0001/UMC 23315 |
ID Code: | 18821 |
Deposited On: | 03. Nov 2015 09:03 |
Last Modified: | 23. Oct 2020 21:29 |