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Eckardt, Susanne Christine (2015): Untersuchungen zum Vorkommen von psychrophilen und psychrotrophen Clostridium spp. in fleischverarbeitenden Betrieben. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

In den letzten Jahren hat ein durch psychrophile und psychrotolerante Clostridium spp. ausgelöstes Verderbsgeschehen bei vakuumverpacktem Rindfleisch, bei dem es zum Aufgasen der Vakuumverpackungen kommt, immer mehr an Bedeutung gewonnen. Neben C. estertheticum und C. gasigenes wurden eine Reihe verschiedener psychrophiler Clostridien beschrieben, die die Fähigkeit für dieses Verderbsgeschehen besitzen. Da divergente Beschreibungen dieser verderbsverursachenden Bakterien vorliegen, wurden sechs psychrotolerante Clostridien-Referenzstämme phänotypisch untersucht und die Ergebnisse mit bereits bestehenden Studien verglichen. Dabei wurden insbesondere hinsichtlich des Hämolyseverhaltens auf Blutagarplatten sowie der Größe der vegetativen Zellen abweichende Ergebnisse ermittelt. Bei der Untersuchung von C. gasigenes wurden obendrein im letzten Drittel der Stäbchen deutliche Querfortsätze beobachtet, die nach derzeitigem Kenntnisstand bisher in der Literatur nicht beschrieben wurden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mehr Erkenntnisse über das Vorkommen und die Verbreitung von psychrotoleranten Clostridien in fleischverarbeitenden Betrieben zu erlangen. Im Vorfeld dazu wurde die Nachweisbarkeit von C. estertheticum-Sporen von unterschiedlichen, häufig in fleischverarbeitenden Betrieben vorkommenden Oberflächen mittels Wattetupfern überprüft. Dabei konnten Sporen auf Kunststoff- und Edelstahloberflächen nachgewiesen werden, wobei die Nachweisintensität bei glatten Kunststoff- und Edelstahloberflächen annähernd gleich ausfiel, während die Nachweisintensität bei eingekerbten Kunststoffoberflächen deutlich abnahm. Da bislang kein PCR-System zum Nachweis von C. bowmanii und C. frigoris vorhanden war, wurde zur Beantwortung der Fragestellung ein neues PCR- System entwickelt sowie das von Broda et al. (2003a) entwickelte System zum Nachweis von C. gasigenes modifiziert. Bei Anwendung der konventionellen Gelelektrophorese lag die Nachweisgrenze von vegetativen Zellen im Bereich von 10 bis 10³ Organismen/ml Fleischtropfsaft. Bei Anwendung des Experion Automated Electrophoresis System mit vorangehender Aufreinigung der PCR-Produkte lag die Nachweisgrenze zwischen 10³ und 10^4 Organismen/ml Fleischtropfsaft. Die Nachweisgrenze für Sporen von C. frigoris und C. gasigenes war sowohl bei Anwendung der konventionellen Gelelektrophorese als auch bei Anwendung des Experion Automated Electrophoresis Systems für den jeweiligen Keim identisch. Sie lag bei C. frigoris bei 10^5 Organismen/ml Fleischtropfsaft, bei C. gasigenes bei 10² Organismen/ml Fleischtropfsaft. Die Nachweisgrenze für Sporen von C. bowmanii konnte aus technischen Gründen nicht ermittelt werden. Beim Vergleich des konventionellen sowie des automatisierten Elektrophorese-Systems zeigte sich, dass es bei einer Aufreinigung der PCR-Produkte zu DNA-Verlusten kommen kann, die sich in der Ermittlung der Nachweisgrenze widerspiegeln. Wird auf eine Aufreinigung verzichtet, führen beide Elektrophorese-Methoden zu gleich guten Ergebnissen. Abschließend wurden drei fleischverarbeitende Betriebe auf das Vorkommen von C. estertheticum, C. gasigenes, C. frigoris und C. bowmanii unter Anwendung der entwickelten Methoden untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass in jedem Betrieb C. estertheticum und C. estertheticum-like Organismen vorhanden waren. C. frigoris wurde ebenfalls in allen Betrieben detektiert, jedoch mit deutlich geringerer Häufigkeit, wohingegen C. bowmanii nur in einer Probe in Betrieb C nachweisbar war. C. gasigenes wurde ebenfalls nur in Betrieb C an zwölf verschiedenen Beprobungsstellen nachgewiesen. In den drei Betrieben wurden unterschiedliche Maßnahmen zur Eliminierung der psychrotoleranten Clostridien ergriffen und der Erfolg der Maßnahmen durch erneute Untersuchungen kontrolliert. Dabei wurde deutlich, dass durch die Verbesserung der allgemeinen Betriebshygiene und durch die Anwendung von peressigsäurehaltigen Desinfektionsmitteln die Nachweisbarkeit von psychrotoleranten Clostridien erheblich gesenkt werden konnte. Durch die Grundsanierung eines ursprünglich stark kontaminierten Betriebes wurde erreicht, dass keine der im Anschluss daran genommenen Tupferproben zu einem positiven Ergebnis auf psychrotolerante Clostridien führte.

Abstract

In the last few years the spoilage of vacuum-packed, refrigerated beef due to psychrophilic and psychrotolerant clostridia, including production of gas inside the pack, has gained in importance. In addition to C. estertheticum and C. gasigenes, further psychrophilic clostridia have been described, which are able to cause Blown Pack Spoilage. Because there are divergent descriptions of these spoilage-causing bacteria, the phenotypic characteristics of the reference strains of six psychrotolerant clostridia were examined and the results were compared. In doing so, dissent results have been detected especially concerning hemolysis on blood agar plates as well as size of the vegeta- tive cells. The examination of C. gasigenes showed that there are distinct transverse pro- cesses in the last third of the rods of C. gasigenes, which, at present state of knowledge, have not been mentioned in the literature yet. The intention of this study was, to get more findings about the occurrence and the dissemination of psychrotolerant clostridia in meat abattoirs. Previously, the traceability of spores of C. estertheticum from different surfaces, which often occur in meat abattoirs, with cotton wool wads, has been checked. In doing so, spores could be detected from surfaces of plastic and stainless steel, whereat the intensity of detection was almost the same with smooth plastic surfaces and stainless steel surfaces. With notched plastic surfaces, the intensity of the PCR products clearly declined. Since until know no PCR method for the detection of C. frigoris and C. bowmanii existed, a new PCR method was developed in order to be able to an- swer the question. Furthermore, the method by Broda et al. (2003a) for the detection of C. gasigenes was modified. In using conventional gelelectrophoresis, the detection limit for vegetative cells was between 10 and 10³ organisms/ml meat drip. When using Experion Automated Electrophoresis System with preceding clean-up of the PCR products, the detection limit for vegetative cells was between 10³ and 10^4 organisms/ml meat drip. The detection limit of spores of C. frigoris und C. gasigenes was identically by using conventional gelelectrophoresis and Experion Automated Electrophoresis System, respectively. With C. frigoris, the PCR-method was capable of detecting 10^5 spores/ml meat drip and with C. gasigenes 10² spores/ml meat drip. Because of technical reasons, it was not possible to determine the limit of detection of spores of C. bowmanii. By comparing the conventional and the automated electrophoresis system it arose, that there can be a loss of DNA when PCR products are cleaned up. This is reflected in the detection limit. When disclaiming the clean-up of PCR products, both methods lead to similar good results. In the end, three meat abattoirs were examined on the occurrence of C. estertheticum, C. gasigenes, C. frigoris and C. bowmanii by using the deve- loped methods. The results have shown, that C. estertheticum and C. estertheticum-like organisms were present in each of these plants. C. frigoris was detected, too, in all of the meat plants, but with much less frequency, whereas C. bowmanii was only detected in one sample of company C. C. gasigenes was only detected in company C as well, at twelve different sampling places. Different actions have been taken place in the three meat plants to eliminate psychrotolerant clostridia. Another check of these abattoirs should indicate, if these measures were successful. It became apparent, that by increasing the general hygiene policy and by using disinfectants with peracetic acid, the detection frequency of psychrotolerant clostrida could be declined considerably. With the extensive reconstruction of an originally heavy contaminated plant, it was achieved, that none of the swab samples, which were taken following to it, were tested positive for psychrotolerant clostridia.