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Popp, Sarah-Teresa (2015): Auswirkung präanalytischer Einflussgrößen auf die Konzentrationen ausgewählter Stoffwechselhormone - sowie Einfluss von Alter und Fastendauer auf spezifische Stoffwechselhormone bei der Ratte, Impact of preanalytical factors on the concentration of specific metabolic hormones and effect of age and fasting on specific metabolic hormones in rats. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Die biochemische Analyse von Hormonen wird durch drei Variablen beeinflusst – die präanalytischen, analytischen und postanalytischen Variabilität. Bezüglich der analytischen und biologischen Variabilität wurden für Nager schon zahlreiche Arbeiten veröffentlicht, jedoch ist die Präanalytik in der Untersuchung von Blutproben von Ratten, in Bezug auf die Hormonanalytik, bislang kaum beachtet worden. Deswegen wurden in dieser Arbeit einige Aspekte der Präanalytik bei der Hormonmessung in Ratten genauer untersucht; auch um Anhaltspunkte zu geben, in wie weit vorbehandelte Blutproben von Ratten zur Messung unterschiedlicher Hormone genutzt werden können und wie sich die Verwendung unterschiedlicher Probenmaterialien, als auch Einfrier-Auftau-Zyklen, auf die Messergebnisse verschiedener Stoffwechselhormone auswirken können. In Bezug auf die biologische Variabilität wurde der Einfluss von Alter und Fasten auf ausgewählte Stoffwechselhormone bei der Ratte genauer untersucht. Ziel dieser Arbeit war es, in Analyseprozessen insbesondere auf den Faktor „Präanalytik“ einzugehen und aufzuzeigen, in welchem Ausmaß Ergebnisse in der Messung von Hormonen mittels Immunassays beeinflusst werden können. Im Vergleich zu reinem Serum waren die gemessenen Konzentrationen von IGF-I (+9,2%, p<0,001), IGF-II (+24,0%, p<0,001), IGFBP-3 (+24,0%, p<0,001) und Leptin (+54,9%, p<0,0001) in EDTA-Plasma signifikant niedriger, GH (-137,8%, p<0,001) und Gesamt-Ghrelin (-10,8%, p<0,05) zeigten erhöhte Werte, für IGFBP- 2, Gesamt-GIP, aktives GLP-1, Insulin und Gesamt-Ghrelin zeichneten sich keine Differenzen ab. Nach zehn Einfrier-Auftau-Zyklen von Serum blieben die Konzentrationen von GH, IGF-I, IGFBP-2 und aktivem GLP-1 unverändert, bei Gesamt-GIP (+49,8%, p<0,001), Insulin (+32,9%, p<0,001) und Gesamt-Ghrelin (+24,6%, p<0,001), konnte eine geringere Menge detektiert werden und bei IGF-II (-25,9%, p<0,01), IGFBP-3 (-19,3%, p<0,001) und Leptin (-41,3%, p<0,001) wurden höhere Werte gemessen. EDTA-Plasmaproben, die ab dem Moment der Abnahme von der Ratte bis zum gefrorenen Aufbewahren ununterbrochen gekühlt wurden, zeigten keine signifikanten Unterschiede zu solchen Proben, die bei Raumtemperatur bis zum Einfrierprozess aufbewahrt wurden. Die Zugabe von Proteaseinhibitoren, im Speziellen von DPP-4-Inhibitor, ist für die Bestimmung von Inkretinhormonen angezeigt. In dieser Studie wurde keine erhöhte Variabilität durch den Zusatz der Proteaseinhibitoren auf die Messung von Gesamt-GIP und aktivem GLP-1 gefunden. Für die Messung von acyliertem Ghrelin ist eine Ansäuerung des Probenmaterials mit HCl empfehlenswert. IGF-II, IGFBP-2, IGFBP-3, Gesamt-GIP und Insulin konnten mit dieser Probenvorbehandlung bedenkenlos gemessen werden. Für Leptin (-73,91%, p<0,05) wurden erhöhte Konzentrationen detektiert, IGF-I (+11,9%, p<0,001) und Gesamt-Ghrelin (+27,1%, p<0,05) zeigten hingegen verringerte Werte. In Bezug auf die biologische Variabilität konnte ebenfalls ein signifikanter Einfluss des Alters und Fastens auf Ratten detektiert werden. Jungtieren hatten einen deutlicher niedrigeren Insulinspiegel (+0,22%, p<0,05) im Blut, bei einer Fastendauer von 16 Stunden, im Vergleich zu wesentlich älteren 1-Jahr alten Ratten. Im Vergleich der Insulinwerte zwischen 6 und 16 Stunden des Fastens konnten signifikant niedrigere Werte nach 16 Stunden festgestellt werden (+30,7, p<0,05). Bei jungen Ratten reduzierte sich die Gesamt-GIP-Konzentration (+105,9%, p<0,01) während des Fastens stärker als bei alten Tieren, aber bei diesem Hormon ist, bei Langzeitfasten aller Tiere, eine signifikante Reduktion der Gesamt- GIP-Konzentration (66,8%, p<0,05) im Vergleich von 6 zu 16 Stunden zu verzeichnen gewesen. Bei IGF-I und Gesamt-Ghrelin veränderten sich die Konzentrationen der zirkulierenden Hormone im Blut trotz einer Fastendauer von 16 Stunden nicht signifikant. Es konnten in dieser Arbeit einige Faktoren der Präanalytik, im Speziellen in der Messung von Hormonen mittels Immunassays bei Ratten, untersucht werden, jedoch sind auf diesem Themengebiet noch zahlreiche weitere Fragestellungen, wie zum Beispiel der Einfluss von Einfrier-Auftau-Zyklen auf EDTA-Plasma oder der Einfluss von Matrixeffekten auf Western Liganden Blot, noch nicht näher untersucht, weswegen es sinnvoll erscheint diesbezüglich weitere Studien anzuschließen.

Abstract

Biochemical analysis of hormones is influenced by three factors – preanalytical, analytical and postanalytical variability. For analytical und biological variability many studies have been published, but the preanalytical measurement of hormones is less examined for blood samples in rats. Therefore we investigated in some issues of preanalytical hormone measurement, to give evidence, if pretreated blood samples also can be used for measuring different hormones and how the usage of different blood sample materials (serum or EDTA-plasma) can affect the measured concentrations of different metabolic hormones. Furthermore the influence of freeze and thawing cycles on the concentrations of different metabolic hormones has been studied. We also investigated in two compounds of the biological variability: the influence of age and fasting on specific metabolic hormones in rats. With this study we aimed to point out the factor “preanalytic“ in the analytical processes and we were able to show how much the results of hormone measurement, detected by immunassays, can be influenced by these components. In relation to plain serum the concentrations of IGF-I (+9.2%, p<0.001), IGF-II (+24.0%, p<0.001), IGFBP-3 (+24.0%, p<0.001) and leptin (+54.9%, p<0.0001) had significantly lower levels in EDTA-plasma whereas GH (-137.8%, p<0.001) and total Ghrelin (-10.8%, p<0.05) showed significant higher levels and for IGFBP- 2, total GIP, active GLP-1, insulin and total Ghrelin there has been no significant difference. After ten freezing and thawing cycles of serum the concentrations of GH, IGF-I, IGFBP-2 and active GLP-1 have not changed, however lower concentrations have been detected for total GIP (+49.8%, p<0.001), insulin (+32.9%, p<0.001) and total Ghrelin (+24.6%, p<0.001). For IGF-II (-25.9%, p<0.01), IGFBP-3 (-19.3%, p<0.001) and leptin (-41.3%, p<0.001) higher concentrations have been measured after ten freezing and thawing cycles. Comparing blood samples, kept at room temperature during treatment until getting frozen for long-time storage, to those blood samples, which have been stored on ice until long-time storage there have no significant differences been detected. The addition of protease inhibitors, especially the addtiton of DPP-4-inhibitor, is advised for the measuring of incretins. In this study no higher variability in case of adding protease inhibitors to blood samples has been detected in the measurement of total GIP and active GLP-1. The addition of HCl to blood samples is recommended for measuring active Ghrelin, but IGF-II, IGFBP-2, IGFBP-3, total GIP and insulin can also be measured from this pretreated blood samples without deviation in their hormone concentrations. After addition of HCl for leptin (- 73.91%, p<0.05) higher concentrations have been detected and for IGF-I (+11.9%, p<0.001) and total Ghrelin (+27.1%, p<0.05) lower concentrations have been measured. As a component of the biological variability, there has also been a significant influence of age and fasting in rats. Young rats (14 weeks old) had lower levels of insulin (0.22%, p<0.05) after fasting for 16h in relation to one year old rats. When comparing insulin concentrations after 6 and 16h of fasting there have been significant lower levels after 16h (+30.7%, p<0.05). While fasting, the concentration of total GIP (+105.9%, p<0.01) was more reduced in young rats than in old ones. Furthermore there was a significant reduction of total GIP after 6 to 16h of fasting (66.8%, p<0.05). For IGF-I and total Ghrelin there was no difference in fasting the rats for 6 or 16h. In this study we investigated some aspects of preanalytic, especially in the measurement of circulating metabolic hormones by immunoassay in rats. However there are still much more topics to be researched, like the influence of freezing and thawing cycles on hormone concentrations in EDTA-plasma or the impact of matrix effects on Western ligand blot.