Breaking symmetry

Visco, Ilaria (2015): Breaking symmetry: reconstitution of unmixing and polarization events in model membranes. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Polarity is a fundamental feature of almost all cells. It generally refers to the asymmetric organization of several cellular components. The plasma membrane, for example, exhibits both a transbilayer and a lateral asymmetry in most eukaryotic cells. Lipids are asymmetrically distributed between the cytoplasmic and the extracellular leaflet of the membrane and segregate laterally together with specific proteins to form dynamic nanoscale assemblies, known as rafts. Polarity can also specifically describe the asymmetric distribution of key molecules within a cell. These molecules, known as polarity determinants, can orient a multitude of specialized cellular functions, such as cell shape, cell division and fate determination. In the framework of this thesis, we aimed to reconstitute essential features of membrane unmixing and cell polarity with a "bottom-up" synthetic biology approach. We worked with both: pure lipid systems, whose unmixing is driven by the asymmetric distribution of lipids in the two leaflets, and a lipid-protein system, whose polarization is instead due to reaction-diffusion mechanisms. In both cases, we used Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) and Sup- ported Lipid Bilayers (SLBs) to model biological membranes and employed modern biophys- ical techniques, such as fluorescence correlation spectroscopy, to quantitatively characterize lipid bilayers and protein-lipid interactions. In the pure lipid systems, we first reconstituted membrane transbilayer asymmetry, applying a cyclodextrin-mediated lipid exchange method, which enables us to enrich membranes with lipids of choice. The enrichment of the membrane with sphingomyelin and/or cholesterol triggers the segregation of lipids into two coexisting asymmetric phases both in SLBs and GUVs, whereas exchanging different amounts of phosphatidylglycerol with the outer leaflet of the GUV membranes controls vesicle shape. Tuning the lipid content of model membranes revealed that small changes in the composition of one leaflet affect the overall lipid miscibility of the bilayer and that membrane shape transformations are possible also in absence of a protein machinery and as a consequence of the lipid redistribution in the membrane. In the protein-lipid system, we aimed to reconstitute a minimal polarization system inspired by the C. elegans embryo at one-cell stage, which polarize along the anterior-posterior axis by sorting the PARtitioning defective (PAR) proteins into two distinct cortical domains. In this system polarity is maintained by the mutual inhibition between anterior (aPARs: PAR-3, PAR-6 and PKC-3) and posterior (pPARs: PAR-1, PAR-2 and LGL-1) PARs, which reciprocally antagonize their binding to the cortex, mutually excluding each other. We focused on LGL-1, which acts directly on PAR-6. Submitting LGL-1 to model membranes allowed us to identify a conserved region of the protein that binds negatively-charged membranes and to determine its lipid binding affinity and specificity. Selected LGL-1 mutants were then gen- erated to better understand the electrostatic mechanism involved in the membrane binding. LGL-1 was finally combined with PKC-3 to generate a functional membrane binding switch.

Abstract

Polarität ist eine Grundeigenschaft fast aller Zellen und bezeichnet die asymmetrische Organ- isation verschiedener zellulärer Bestandteile. Zum Beispiel besitzt die Zellmembran bei den meisten eukaryotischen Zellen sowohl eine Asymmetrie zwischen als auch innerhalb der Lipid- schichten. Das heißt, Lipide sind asymmetrisch in der zytoplasmatischen und der extrazel- lulären Lipidschicht der Membran verteilt und bilden zusammen mit spezifischen Proteinen auf lateraler Ebene dynamisch-geordnete Nanostrukturen, sogenannte Lipid Rafts. Polarität kann zudem die asymmetrische Verteilung bestimmter Schlüsselmoleküle innerhalb einer Zelle beschreiben. Diese als Polaritätsdeterminanten bekannten Moleküle bedingen eine Vielfalt spezieller Zellfunktionen so wie z.B. Zellform, Zellteilung und Zellschicksal. Diese Arbeit versucht wesentliche Eigenschaften von Zell- und Membranpolarität mit Hilfe des sogenannten “Bottom-up”-Ansatzes (“von unten nach oben”) der synthetischen Biologie nachzubilden. Es wurden zwei Systeme etabliert, um Polarisation mit Minimalsystemen zu reproduzieren. Zum einen reine Lipidsysteme, deren Polarisation durch die asymmetrische Verteilung von Lipiden in den zwei Lipidschichten entsteht, zum anderen Lipid-Proteinsysteme, deren Polarisation sich stattdessen aus Reaktions-Diffusions Mechanismen herleitet. In beiden Fällen wurden Riesenvesikel (GUVs) sowie gestützte Lipiddoppelschichten (SLBs) für die Modellierung biologischer Membranen verwendet und moderne biophysikalische Techniken, wie die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, für eine quantitative Charakterisierung von Lipiddoppelschichten und Protein-Lipid Interaktionen angewendet. Um die Asymmetrie der Membrandoppelschicht in reinen Lipidsystemen zu rekonstruieren, wurde eine Anreicherung einer der Lipidschichten der Membran mit den gewünschten Lipiden durch Anwendung eines mit Cyclodextrin kontrollierten Lipidaustauschprotokolls vorgenommen. Die Anreicherung der Membran mit Sphingomyelin und/oder Cholesterol induzierte die Aufteilung der Lipide in zwei koexistierende, asymmetrische Phasen sowohl in SLBs als auch GUVs. Die Vesikelform hingegen wurde durch den Austausch verschiedener Mengen Phosphatdylglycerol in deräusseren Lipidschicht der GUV-Membranen verändert. Eine Anpassung des Lipidgehaltes von Membranen im Modellsystem zeigte, dass kleine Änderungen in der Zusammensetzung einer Lipidschicht die Mischbarkeit der Lipide der Doppelschicht beeinflusst und dass Formveränderungen der Membran, selbst in Abwesenheit eines Proteingerüstes, als Konsequenz einer Lipidumverteilung in der Membran möglich sind. Im Protein-Lipid System wurde die Nachbildung eines Minimalpolarisationssystems angestrebt, wie man es beim C. elegans Embryo im Einzellstadium beobachten kann. Dieser wird durch Anordnung der PARtitioning defective (PAR) Proteine in zwei unterschiedliche kortikale Bereiche entlang der Vorder-Hinterachse polarisiert. In dem PAR-System wird die Polarität durch gegenseitige Inhibition der vorderen (aPARs: PAR-3, PAR-6 und PKC-3) und hinteren (pPARs: PAR-1, PAR-2 und LGL-1) PAR-Proteine aufrechterhalten. Diese hemmen die gegenseitige Bindung an den Kortex. Da LGL-1 direkt auf PAR-6 einwirkt, wurde es als potentielles Schüsselmolekül der Zellpolarization in künstlichen Membranen rekonstruiert. Durch Rekonstruktion von LGL-1 in Membranmodellen konnte die konservierte Region des Proteins, die mit negativ geladenen Membranen interagiert, sowie dessen Bindungsanität und -Spezifität gegenüber Lipiden quantitativ gemessen werden. Darauf folgend wurden LGL- 1 Mutationen hergestellt, um die bei der Membranbindung auftretenden elektrostatischen Mechanismen besser zu verstehen. Zuletzt wurden LGL-1 und PKC-3 kombiniert, um die Membranbindung von LGL-1 reproduzierbar zu inhibieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 30. Juli 2015
• 1. Bericht­erstatter:in: Jung, Kirsten