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Uhl, Patrizia Barbara (2015): Differentielle Proteomanalyse und Charakterisierung von Oberflächenproteinen des retinalen Pigmentepithels gesunder und an ERU erkrankter Pferde. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine sehr häufig auftretende autoimmune Augenerkrankung bei Pferden, welche meist mit dem Verlust der Sehfähigkeit der betroffenen Augen einhergeht. Da die ERU das einzig spontane Tiermodell für die humane autoimmune Uveitis darstellt, ist die Erforschung der zugrundeliegenden Pathomechanismen der ERU nicht nur veterinärmedizinisch, sondern auch für die Humanmedizin von großer Bedeutung. Charakteristisch für die ERU sind der Zusammenbruch der Blut-Retina-Schranke (BRS) und die Infiltration von autoaggressiven T-Lymphozyten in das innere Auge mit anschließender Zerstörung retinaler Strukturen. Beim Pferd wird die BRS, aufgrund der weitestgehend avaskulären Retina, hauptsächlich von der äußeren Komponente der BRS gebildet, dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Im physiologischen Zustand stellt das RPE durch feste Zell-Zellverbindungen sowohl eine stabile mechanische, als auch durch seine Fähigkeit, mit Mediatoren des Immunsystems kommunizieren und interagieren zu können, eine effektive immunologische Barriere dar. Die im Verlauf der ERU stattfindenden pathophysiologischen Mechanismen, welche für den Zusammenbruch dieser Barriere verantwortlich sind, konnten bislang nicht ausreichend geklärt werden. Vor allem Änderungen im Expressionsmuster des Zelloberflächenproteoms könnten hierbei aufgrund der ständigen Interaktion und Kommunikation der RPE-Zellen mit ihrer Umgebung eine entscheidende Rolle spielen. Deshalb war es das Ziel dieser Arbeit, differentiell regulierte Zelloberflächen-proteine zwischen gesunden und uveitischen RPE-Zellen zu detektieren, welche maßgeblich an der Pathogenese der ERU beteiligt sein könnten. Um so nah wie möglich die am RPE in vivo stattfindenden physiologischen und pathophysiologischen Prozesse widerspiegeln zu können, wurden RPE-Zelloberflächenproteine von gesunden und an ERU erkrankten Pferden in dieser Studie mittels einer neuartigen in situ Biotinylierungsmethode angereichert und anschließend massenspektrometrisch analysiert. Dabei konnten insgesamt 148 Proteine identifiziert werden, von denen 81,8 % Plasmamembranproteine waren, was deutlich für den Erfolg der neuartigen Anreicherungsmethode sprach. Unter den 148 insgesamt identifizierten Proteinen befanden sich 27 differentiell regulierte Proteine, wovon in uveitischem RPE drei hoch- und 24 herunterreguliert waren. Neben den für RPE-Zellen klassischen Proteinen wie RPE65, Rhodopsin und S-Arrestin konnten auch mehrere Proteine detektiert werden, die unseres Wissens zuvor noch nicht in RPE-Zellen beschrieben wurden, wie der Glukosetransporter 4, Synaptotagmin 1 und Peripherin 2. Funktionell besonders interessant fanden wir die vier Proteine Synaptotagmin 1, Basigin, Collectrin und Perpherin 2, welche alle mit einer verminderten Expression in uveitischem RPE zu finden waren. Interessanterweise ergab sich aus einer Pathway-Analyse für alle vier Proteine eine Beteiligung an „Visual Functions“ und „Immunological Diseases“. Mittels weiterführender Analysen wie der Durchflusszytometrie, der Immunhistologie und der Quantifizierung der Protein-Fluoreszenzintensitäten ist es gelungen die bereits massenspektrometrisch identifizierte verminderte Expression von Synaptotagmin 1, Basigin, Collectrin und Perpherin 2 zu verifizieren und die Proteine näher zu charakterisieren. Die in dieser Arbeit präsentierte neuartige in situ Biotinylierungsmethode zur Anreicherung von Oberflächenproteinen, welche anschließend mittels LC-MS/MS identifiziert wurden, erwies sich als sehr effektive und innovative Methode, um Oberflächenproteine so nah wie möglich in ihrem physiologischen und pathophysiologischen in vivo Vorkommen zu untersuchen. Daher liefert der in dieser Arbeit generierte Datensatz der differentiell regulierten Proteine zwischen gesunden und uveitischen RPE-Zellen eine solide Grundlage für weitere funktionelle Analysen zur Aufklärung der Pathogenese der ERU.

Abstract

Equine recurrent uveitis (ERU) is a highly prevalent autoimmune eye disease in horses, which usually results in blindness of affected eyes. Since ERU is the only spontaneous animal model for human autoimmune uveitis, investigations of underlying pathomechanisms of ERU are not only of high importance for veterinary medicine, but also for human medicine. Characteristic features of ERU are the breakdown of blood-retinal barrier (BRB) and infiltration of autoaggressive T-lymphocytes into the inner eye with subsequent destruction of retinal structures. The BRB of the horse is, due to its widely avascular retina, formed by the outer component of the BRB, the retinal pigment epithelium (RPE). Based on its strong cell-cell connections, the RPE constitutes a solid mechanical barrier and due to its ability to communicate and interact with mediators of the immune system, an effective immunological barrier under physiological conditions, as well. Pathophysiological mechanisms taking place in course of ERU, which are responsible for the breakdown of BRB, were not sufficiently clarified to date. In this context, especially changes of cell surface proteome could play a decisive role due to the continuous communication and interaction of the RPE cells with their environment. Therefore, the goal of this study was to detect differentially expressed cell surface proteins of healthy and uveitic RPE cells, which might crucially contribute to the pathogenesis of ERU. To reflect physiological and pathophysiological processes taking place at the RPE as close as possible to the in vivo situation, cell surface proteins of RPE cells of healthy and ERU diseased horses were captured by a novel in situ biotinylation method and afterwards analyzed by mass spectrometry. Thereby, a total of 148 proteins were identified, of which 81.8 % were plasma membrane proteins, representing the success of this novel enrichment method. 27 of 148 totally identified proteins were differentially expressed. Among these, three proteins were upregulated and 24 proteins were downregulated in uveitic RPE. In addition to proteins typically expressed by RPE cells like RPE65, rhodopsin and S-arrestin, several proteins like glucose transporter 4, synaptotagmin 1 and peripherin 2 were detected, which to our knowledge were not described in RPE cells so far. Of high functional interest to us were four proteins, namely synaptotagmin 1, basigin, collectrin and peripherin 2, which were all downregulated in uveitic RPE cells. Interestingly, a pathway analysis showed involvement of all four proteins in “visual functions” and “immunological diseases”. By performing further analysis such as flow cytometry, immunohistochemistry and quantification of fluorescence intensities, reduced expression of synaptotagmin 1, basigin, collectrin and peripherin 2, which were identified by mass spectrometry, was verified and the proteins were further characterized. In this study, a novel in situ biotinylation method used for cell surface protein enrichment with following identification of these proteins by LC-MS/MS was undertaken. The method proved to be an effective and innovative method to investigate cell surface proteins as closely as possible to their physiological and pathophysiological appearance in vivo. Therefore, the data set of differentially regulated proteins of healthy and uveitic RPE cells, which was generated within the present study, sets a great foundation for further functional analysis for clarifying the pathogenesis of ERU.