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Lettmann, Sarah (2015): Einfluss der intestinalen Mikroflora auf die Entwicklung des mukosalen Immunsystems des Hühnerdarms. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Ein voll entwickeltes Immunsystem ist für die Tiergesundheit und damit auch für das Tierwohl von entscheidender Bedeutung. Dies gilt insbesondere in der intensiven Geflügelhaltung, in der das häufige Auftreten von Infektionserkrankungen durch präventive Impfmaßnahmen oder den Einsatz von Antibiotika kontrolliert wird. Letzterer steht derzeit stark in der Kritik und hat zur intensiven Suche nach Alternativen geführt. Arbeiten der letzten Jahre haben gezeigt, dass die strukturelle und funktionelle Entwicklung des Immunsystems von Mäusen entscheidend von der intestinalen Mikroflora beeinflusst wird. Für landwirtschaftliche Nutztiere und insbesondere für das Geflügel gibt es hierzu nur wenige, überwiegend sehr alte Untersuchungen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher die Bedeutung einer mikrobiellen Besiedelung des Darms nach dem Schlupf für die Entwicklung des Immunsystems und insbesondere des Darmimmunsystem von Hühnern untersucht werden. Als methodischer Ansatz wurde der Vergleich von keimfrei gehaltenen und konventionell gehaltenen Hühnern gewählt. In die Studie miteinbezogen wurden zwei weitere Tiergruppen, welche mit probiotischen Bakterien rekonstituiert wurden. Eine dieser Gruppen wurde mit dem Escherichia coli Nissle 1917 Stamm mono-rekonstituiert (Mono-Gruppe), die zweite Gruppe erhielt eine Mischung aus den vier Bakterienstämmen Escherichia coli Nissle, Enterococcus faecium, Lactobacillus rhamnosus und Clostridium butyricum (Tetra-Gruppe). Die Untersuchung des Darms der Tiere erfolgte auf morphologischer (Immunhistologie), transkriptioneller (Genexpressionsanalysen) und funktioneller (Immunglobulin-quantifizierung) Ebene. Dabei konnte bei keimfrei gehaltenen Hühnern morphologisch eine massiv reduzierte Anzahl an B-Lymphozyten und das Fehlen von Germinalen Zentren, isolierten lymphatischen Follikeln und der IgA- und IgY-Produktion im Darm festgestellt werden. Dagegen war der Effekt einer fehlenden mikrobiellen Besiedlung auf die T-Lymphozyten im Darm vergleichsweise gering. Für die Zellen des angeborenen Immunsystems konnten morphologisch keinerlei Unterschiede zwischen den untersuchten Tiergruppen festgestellt werden. Der Phänotyp der mono-rekonstituierten Hühner lag hinsichtlich des histologisch erfassten Entwicklungsstandes zwischen der Keimfrei- und der Tetra-Gruppe, die Tetra-Gruppe kam der konventionellen Gruppe am nächsten. Die auf morphologischer Ebene beobachtete Unterentwicklung des Darmimmunsystems der Keimfrei-Gruppe konnte auch auf transkriptioneller Ebene bestätigt werden. Bei den mikrobiell kolonisierten Tiergruppen (konventionell, mono-rekonstituiert, tetra-rekonstituiert) waren zahlreiche immunrelevante Gene signifikant höher exprimiert als bei den keimfreigehaltenen Tieren. Analog zur Morphologie, waren Gene des B-Lymphozyten Systems bei den höher exprimierten Genen überrepräsentiert. Die bei keimfrei gehaltenen Tieren stärker exprimierten Gene wiesen darauf hin, dass bei diesen Transportprozesse, insbesondere des Energiestoffwechsels und des Wasser- und Elektrolythaushalts, eine Rolle zu spielen scheinen. Es fanden sich außerdem Hinweise auf eine Dysregulation der Immunantwort bei den rekonstituierten, insbesondere den tetra-rekonstituierten Tieren, da es in der Tetra-Gruppe zu einer erhöhten Expression von Genen für proinflammatorische Zytokine und Effektorzellen (CD4+, CD8+) kam. Die makroskopische und histologische Untersuchung der tetra-rekonstituierten Tiere lieferte jedoch keinen Hinweis auf ein inflammatorisches Geschehen in dieser Tiergruppe. Die Immunglobulinproduktion wurde ebenfalls signifikant durch die Mikrobiota beeinflusst. Bis zum 28. Lebenstag konnte im Plasma der keimfrei gehaltenen Tiere keinerlei IgA und lediglich deutlich reduzierte Mengen an IgM nachgewiesen werden, wobei die Mono-Rekonstitution mit E.coli Nissle ausreichte, um annähernd normale IgA- und IgM-Plasmakonzentrationen zu induzieren. Am 55. Lebenstag war die Immunglobulin-Konzentration im Plasma der tetra-rekonstituierten Tiere zwar signifikant höher als in der Keimfrei-Gruppe, fiel jedoch geringer aus als in der konventionellen Gruppe. Die diverse Mikroflora der konventionellen Tiere konnte demnach die humorale Immunantwort längerfristig effizienter stimulieren als die Kolonisierung mit nur vier Bakterienstämmen. Des Weiteren konnte für den probiotischen E.coli Nissle Stamm eine effektive spezifische humorale Immunantwort nachgewiesen werden, wogegen der Enterococcus faecium Stamm weniger immunogen erschien. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine frühe Kolonisierung des Darms mit der richtigen Flora entscheidend für die Entwicklung des Darmimmunsystems des Huhns ist. Die gewonnenen Erkenntnisse liefern wichtige Hinweise für die Entwicklung einer probiotischen Flora, welche an Eintagsküken verabreicht, eine schnelle und korrekte Entwicklung des Immunsystems gewährleistet. Als effektive und unbedenkliche Möglichkeit zur Verbesserung der Tiergesundheit, würde sie längerfristig auch einen Beitrag zur Reduktion des Antibiotikaverbrauchs in der Geflügelindustrie leisten.

Abstract

A fully developed mucosal immune system is essential for animal health and welfare. Intensive livestock farming of poultry is promoting the occurrence of infectious diseases and often leads to increasing use of antibiotics, which is a major concern in public health. Thus, there has been a focus on finding alternative ways to promote intestinal health. While the role of microbial colonization of the gut has been studied intensively in mice, little is known about its relevance for the development of the mucosal immune system in birds. In order to address this question, we raised germ free chickens and reconstituted them with an E.coli strain Nissle alone (mono-group) or in combination with an Enterococcus faecium, Lactobacillus rhamnosus and Clostridium butyricum strain (tetra-group). The intestinal immune system of germ free, conventional, mono-reconstituted and tetra-reconstituted animals was analyzed by immunohistology, gene expression analyses and immunoglobulin quantification. Morphologically, germ free chickens showed a massive reduction of B cells, the complete lack of germinal centers and isolated lymphoid follicles and no IgA and IgY production in the gut. The impact of microbial absence on T cells in the gut was less obvious and no differences in numbers and distribution of innate immune cells between the groups could be detected. Overall, the mono-reconstituted birds showed an intermediate state of development, whereas the development of the intestinal immune system of tetra-reconstituted chickens was similar to conventional birds. The results of the morphological studies could be confirmed by gene expression analyses. Many genes, which were significantly higher expressed in the chickens with microbial colonization, could be related to the immune system, in particular to the B cell system. In contrast, numerous genes, which were higher expressed in germ free birds, were associated with transporter activity, energy intake and metabolism and water and electrolyte homeostasis. Furthermore, there were indications of a dysregulation in the immune response of the reconstituted groups, in particular in the tetra-reconstituted animals, as there was an up regulation of genes encoding for proinflammatory cytokines and effector cells (CD4+, CD8+). Yet, there was no evidence for inflammation found during necropsy or in histology. The microbiota also had a significant impact on the production of immunoglobulins. At day 28 after hatch, there were no IgA and only significantly decreased levels of IgM detectable in plasma of germ free chickens, whereas the mono-reconstitution with E. coli Nissle led to almost normal IgA and IgM concentrations. After 55 days of life, the plasma immunoglobulin levels of tetra-reconstituted birds were significantly higher than in germ free birds, but were still lower than in conventionally raised chickens. Thus, the diverse microbiota of conventional chickens was more efficient in inducing a humoral immune response, than just four bacteria in the long term. Additionally, the bacterial strain specific humoral immune response induced by probiotic E. coli Nissle, seemed to be stronger than the response caused by Enterococcus faecium. This study illustrates the importance of early gut colonization with an adequate microflora for the development of the intestinal immune system in chickens. The achieved knowledge can help to identify a set of natural microorganisms, which could be applied to hatchlings under production conditions to support timely development of a fully functional immune system. This would represent a safe and effective method, as an alternative to antibiotic treatments, to contribute to the improvement of animal and public health in the long run.