A system for time-encoded non-linear spectroscopy and microscopy

Karpf, Sebastian (2015): A system for time-encoded non-linear spectroscopy and microscopy. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

Raman scattering can be applied to biological imaging to identify molecules in a sample without the need for adding labels. Raman microscopy can be used to visualize functional areas at the cellular level by means of a molecular contrast and is thus a highly desired imaging tool to identify diseases in biomedical imaging. The underlying Raman scattering effect is an optical inelastic scattering effect, where energy is transferred to molecular excitations. Molecules can be identified by monitoring this energy loss of the pump light, which corresponds to a vibrational or rotational energy of the scattering molecule. With Raman scattering, the molecules can be identified by their specific vibrational energies and even quantified due to the signal height. This technique has been known for almost a century and finds vast applications from biology to medicine and from chemistry to homeland security. A problem is the weak effect, where usually only one in a billion photons are scattered. Non-linear enhancement techniques can improve the signal by many orders of magnitude. This can be especially important for fast biomedical imaging of highly scattering media and for high resolution spectroscopy, surpassing the resolution of usual spectrometers. In this thesis a new system for stimulated Raman spectroscopy (SRS) and hyperspectral Raman microscopy with a rapidly wavelength swept laser is presented. A time-encoded (TICO) technique was developed that enables direct encoding of the Raman transition energy in time and direct detection of the intensity change on the Stokes laser by employing fast analogue-to-digital converter (ADC) cards (1.8 Gigasamples/s). Therefore, a homebuilt pump laser was developed based on a fiber-based master oscillator power amplifier (MOPA) at 1064 nm and extended by a Raman shifter that can shift the output wavelength to 1122 nm or 1186 nm. This is achieved by seeding the Raman amplification in the fiber with a narrowband 1122 nm laser diode. Surprisingly, this also leads to narrowband (0.4 cm-1) cascaded Raman shifts at 1186 nm and 1257 nm, which is in contrast to the usually broadband spontaneous Raman transition in fused silica. The underlying effect was examined and therefore concluded that it is most probably due to a combined four-wave-mixing and cascaded Raman scattering mechanism. Experimentally, the narrowband cascaded Raman line was used to record a high-resolution TICO-Raman spectrum of benzene. As Raman Stokes laser, a rapidly wavelength swept Fourier domain mode-locked (FDML) laser was employed which provides many advantages for SRS. The most important advantages of this fiber based laser are that it enables coverage of the whole range of relevant Raman energies from 250 cm-1 up to 3150 cm-1, while being a continuous wave (CW) laser, which at the same time allows high resolution (0.5 cm-1) spectroscopy. Further, it enables a new dual stage balanced detection which permits shot noise limited SRS measurements and, due to the well-defined wavelength sweep, the TICO-Raman technique directly provides high-quality Raman spectra with accurate Raman transition energy calibration. This setup was used for different applications, including Raman spectroscopy and non-linear microscopy. As results, broadband Raman spectra are presented and compared to a state-of-the-art spontaneous Raman spectrum. Furthermore, several spectroscopic features are explored. For first imaging results, samples were raster scanned with a translational stage and at each pixel a TICO-Raman spectrum acquired. This led to a hyperspectral Raman image which was transformed into a color-coded image with molecular contrast. Biological imaging of a plant stem is presented. The setup further allowed performing multi-photon absorption imaging by two-photon excited fluorescence (TPEF). In summary, this thesis presents the design, development and preliminary testing of a new and promising platform for spectroscopy and non-linear imaging. This setup holds the capability of biological multi-modal imaging, including modalities like optical coherence tomography (OCT), absorption spectroscopy, SRS, TPEF, second harmonic generation (SHG), third-harmonic generation (THG) and fluorescence lifetime imaging (FLIM). Amongst the most promising characteristics of this setup is the fiber-based design, paving the way for an endoscopic imaging setup. Already now, this makes it a robust, alignment-free, reliable and easy-to-use system.

Abstract

Ramanstreuung kann in der biomedizinischen Bildgebung dazu eingesetzt werden, Moleküle in einer Probe zu identifizieren, ohne dass die Probe vorher aufbereitet werden muss. Raman Mikroskopie kann funktionelle Bereiche sichtbar machen, indem es einen molekularen Kontrast auf Größenordnungen der Zellen bereitstellt und wird damit hochinteressant für die Krankheitserkennung in biomedizinischer Bildgebung. Der zugrundeliegende Raman Streuprozess ist ein optisch-inelastischer Streuungsmechanismus der die Detektion von Molekülschwingungen ermöglicht. Dabei wird das gestreute Licht detektiert und die Energiedifferenz zum Anregungslicht entspricht der molekularen Schwingungsenergie. Durch diese molekülspezifischen Schwingungsenergien ist es möglich, die Moleküle zu identifizieren und weiterhin durch die Signalhöhe zu quantifizieren. Diese Technik ist seit nunmehr beinahe einem Jahrhundert bekannt und findet breite Anwendung in Gebieten wie der Biologie, Chemie und der Medizin. Das Problem der Ramanstreuung ist die geringe Signalstärke des Effekts, wobei normalerweise nur eines von einer Milliarde Photonen gestreut wird. Es ist jedoch möglich, diesen Effekt durch nichtlineare Techniken um einige Größenordnungen zu verstärken. Dies wird besonders relevant beim Einsatz in der biomedizinischen Bildgebung von hochstreuendem Gewebe und bei hochauflösender Spektroskopie, wo gewöhnliche, gitterbasierte Spektrometer an ihre Grenzen stoßen. In der vorliegenden Arbeit wird ein neues System zur stimulierten Ramanstreuung (SRS) und hyperspektralen Ramanmikroskopie mittels eines schnell wellenlängenabstimmbaren Lasers vorgestellt. Hierfür wurde eine neue, zeitkodierte (TICO) Technik entwickelt, die es ermöglicht, die abgefragte Raman-Schwingungsenergie in der Zeit zu kodieren und weiter die durch SRS auftretende Leistungssteigerung direkt in der Zeitdomäne aufzunehmen, indem sehr schnelle Analog-zu-Digital-Wandler (ADC) mit 1.8 Gigasamples/s eingesetzt werden. Der hierfür entwickelte Pumplaser ist ein faserbasierter Masteroszillator Leistungsverstärker (MOPA) mit integriertem Ramanwandler, der einen Betrieb bei 1064 nm, 1122 nm oder 1186 nm ermöglicht. Diese Mehrwellenlängenfähigkeit basiert auf dem Ramaneffekt in der Glasfaser, der durch ein Keimlicht einer 1122 nm Laserdiode stimuliert wird. Überraschenderweise wurde dadurch ebenfalls ein schmalbandiger Betrieb (0,4 cm-1) der kaskadierten Ramanbanden bei 1186 nm und 1257 nm beobachtet, was zunächst der erwarteten breitbandigen Ramanbande von Glas widerspricht. Diese Ergebnisse wurden untersucht und es wird ein Modell vorgeschlagen, wonach der gefundene Effekt auf einer Kombination von Vier-Wellen-Mischen und kaskadierter Ramanstreuung beruht. Das schmalbandige kaskadierte Ramanlicht bei 1186 nm wurde im Experiment für hochauflösende Ramanspektroskopie von Benzol benutzt. Als Raman Stokeslaser wurde ein schnell wellenlängenabstimmbarer Fourierdomänen modengekoppelter (FDML) Laser benutzt, der einige Vorteile kombiniert. Als wichtigste Vorteile dieses faserbasierten Lasers sind die breite Abdeckung relevanter Ramanenergien, die sich von möglichen 250 cm-1 bis 3150 cm-1 erstreckt, die gleichzeitig hohe spektrale Auflösung (0.5 cm-1), und der für biologische Bildgebung interessante Dauerstrich-Betrieb (CW) zu nennen. Weiterhin wurde eine neue, zweistufig balanzierte Detektion entwickelt, die SRS Messungen an der Schrotrauschgrenze ermöglichen. Die wohldefinierte Wellenlängen-zu-Zeit Beziehung dieses Lasers wurde darüber hinaus dafür benutzt, den TICO-Raman Spektren direkt Ramanenergien zuzuweisen. Dadurch wurden hochqualitative Ramanspektren mit akkurater Wellenzahlinformation möglich. Das entwickelte System wurde für Anwendungen in der Raman Spektroskopie und nicht-linearen Bildgebung eingesetzt. Als Ergebnisse werden breitbandig abgetastete Ramanspektren präsentiert, die mit spontanen Raman Spektren verglichen werden. Weitere, neue spektrale Anwendungen wurden untersucht und erste Mikroskopiebilder erzeugt. Hierfür wurde die Probe mittels eines Verschiebetisches verfahren und an jedem Pixel ein TICO-Raman Spektrum aufgenommen. Die so erzeugten hyperspektralen Raman Mikroskopiebilder wurden in farbig kodierte Bilder mit molekularem Kontrast umgewandelt. Es wird eine TICO-Raman Mikroskopieaufnahme von einem Pflanzenschnitt präsentiert. Das System erlaubt es ferner, durch den Einsatz des hochintensiven Pumplasers Bilder mit Mehrphotonenabsorption zu messen, indem zweiphotonenangeregte Fluoreszenzbildgebung (TPEF) angewandt wird. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit die Entwicklung eines neuen Systems der Spektroskopie und nichtlinearen Bildgebung beschrieben und erste Messergebnisse präsentiert. Mit diesem System wird es möglich sein, viele verschiedene Bildgebungsverfahren zu verbinden. Darunter unter anderem Bildgebungsverfahren wie die optische Kohärenztomographie (OCT), Absorptionsspektroskopie, SRS, TPEF, Frequenzverdopplung (SHG) und Frequenzverdreifachung (THG) und Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie (FLIM). Der wohl vielversprechendste Vorteil dieses Systems liegt in dem faserbasierten Design, welches es ermöglichen kann dieses System zukünftig zur endoskopischen Bildgebung einzusetzen. Bereits jetzt ergibt dieser faserbasierte Aufbau ein sehr robustes System, das verlässlich, justagefrei und einfach zu bedienen ist.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Raman Microscopy, FDML, Two-Photon Microscopy, fiber lasers
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 15. Juni 2015
• 1. Bericht­erstatter:in: Huber, Robert