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Kuffer, Christian (2015): Proliferation and arrest of human tetraploid cells. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

Durch Fehler entstandene tetraploide Zellen sind chromosomal instabil und können zu Zelltransformation führen. Die Beweise verdichten sich, dass die Propagation von tetraploiden Säugetierzellen durch einen p53-vermittelten Arrest eingeschränkt wird; jedoch ist weiterhin unklar, was die Ursache dieses p53-vermittelten Arrests ist. Um die Ursache des p53-vermittelten Arrests zu identifizieren, wurden individuelle Zellen mittels zeitraffender Mikroskopie in Echtzeit verfolgt. Neu entstandene tetraploide Zellen können einen Zellzyklus vollenden, aber die Mehrzahl der Zellen starb oder verharrte in einem Arrest in der folgenden G1-Phase, abhängig davon ob die vorangegangene Mitose fehlerfrei verlief oder nicht. Tochterzellen, denen eine fehlerhafte Mitose voranging, akkumulierten p53 im Zellkern, was zum Zelltod oder einem irreversiblen Zellzyklusarrest führte. Es zeigte sich durch den Anstieg von 8-OHdG, einem Indikator für oxidative DNA Schädigung, dass tetraploide Zellen durch die vermehrten fehlerhaften Mitosen höheren Konzentrationen von reaktiven oxidativen Spezien (ROS) ausgesetzt sind. Der Anstieg von 8-OHdG korrelierte mit der p53-Akkumulation im Zellkern. Da keine vermehrte Phosphorylierung des Histons H2AX (γ-H2AX), ein Marker für DNA-Strangbrüche, detektiert wurde, lässt sich schlussfolgern, dass ROS entscheidend für den p53 vermittelten Arrest verantwortlich sind. Mehrere p53-aktivierende Kinasen wurden mittels RNA Interferenz (RNAi) und chemischer Genetik untersucht, ob sie einen Einfluss auf den Zellzyklusarrest von tetraploiden Zellen haben. Von den getesteten Kinasen hatte nur ATM einen Einfluss auf die Aktivierung von p53 nach fehlerhaften tetraploiden Mitosen. Zwar wird ATM in der Regel durch DNA-Schäden aktiviert, jedoch wurde bereits zuvor gezeigt, dass ATM auch durch erhöhte ROS Konzentrationen aktiviert werden kann. Um die Zusammenhänge des Zellzyklusarrests weiter aufzuklären, wurde ein genomübergreifender esiRNA Screen etabliert, der die Zellproliferation nach induzierter Tetraploidisierung analysiert. Durch Kombination der Zellzyklusanalyse an Hand des DNA-Gehalts zusammen mit den FUCCI-Zellzyklusindikatoren, konnten tetraploide und diploide Zellen nebeneinander mikroskopisch analysiert werden, ohne zuvor tetraploide und diploide Zellen isolieren zu müssen. Dieser neue experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifikation von Genen, die spezifisch die Proliferation von tetraploiden Zellen verstärken oder einschränken Im Primärscreen wurden 1159 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation einschränken. Weiter wurden 431 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation der tetraploiden Zellen verstärken. Von den 431 Genen, deren Inhibition die Proliferation verstärken, wurden 371 Gene einem Konfirmationsscreen unterzogen, in dem 158 der identifizierten 371 Gene bestätigt wurden. Die bioinformatische Analyse der 158 Gene zeigte eine signifikante Anhäufung von Genen, die mit DNA-Replikation, dem kanonischen Wnt-Signalweg oder mit Tumorsignalwegen assoziiert sind. Unter letzteren ist CCDC6 sehr interessant, da dessen Genprodukt durch ATM phosphoryliert wird und nachgeschaltet den Tumorsuppressor 14-3-3σ reguliert. Des weiteren wurden mittels einer Meta Analyse der Ergebnisse des Primärscreens, zusammen mit den Daten aus dem “Project Achilles”, welches genomweit den Effekt von shRNA-vermittelter Geninhibition auf die Proliferation von 108 Krebszelllinien untersuchte, 18 Gene identifiziert, deren Inhibition sowohl die Proliferation von tetraploiden Zellen einschränkt, als auch die Proliferation von Zelllinien hemmt, welche von Krebsarten stammen, die zu meist chromosomale Instabilitäten (CIN) aufweisen. Damit bilden die präsentierten Daten nicht nur eine gute Basis zur Aufklärung des Zellzyklusarrests tetraploider Zellen, sondern auch für die Identifikation neuer potentieller Zielmoleküle, welche benutzt werden können um Tumorerkrankungen mit chromosomaler Instabilität zu behandeln, welche häufig resistent gegen die bislang verfügbaren Behandlungen sind.

Abstract

Erroneously arising tetraploid mammalian cells are chromosomally unstable and may facilitate cell transformation. An increasing body of evidence suggests that the propagation of mammalian tetraploid cells is limited by a p53-dependent arrest, however, the triggers of this arrest have thus far not been identified. To elucidate the timing and causes of this arrest, time-lapse live cell imaging was performed to track the fate of individual cells immediately after tetraploidization. Newly formed tetraploid cells can progress through one cell cycle, but the majority of cells arrest or die in the subsequent G1 stage, with the fate of these tetraploid cells determined by the preceding mitosis. Daughter cells arising from defective mitosis accumulated p53 in the nucleus, which led to irreversible cell cycle arrest or death. Furthermore this p53 accumulation coincides and correlates with an increase of the oxidative DNA damage marker 8-OHdG, suggesting an increase in reactive oxygen species (ROS), but does not coincide with the phosphorylation of H2AX (γ-H2AX), a marker for canonical DNA damage. Using RNA interference and chemical genetics, several p53 activating kinases were tested for their contribution to the cell cycle arrest of tetraploid cells. Of the tested kinases, only ATM was shown to play a role in the activation of p53 after defects in mitosis. ATM kinase is a DNA damage-responsive kinase, however, it has been shown that increased ROS levels activate ATM in a non-canonical way. To gain further insights into arrest of tetraploid cells, an unbiased genome-wide esiRNA screen was performed to analyze cell proliferation after induced tetraploidization. Using FUCCI cell cycle probes, combined with DNA content cell cycle profiling, allowed an image-based assay to examine tetraploid and diploid cells side-by-side. This novel approach enabled us to screen for genes that specifically restricts or enhances cell proliferation after tetraploidization, if inhibited by esiRNA mediated knockdown. From the primary screen we identified 1159 genes that decreased and 431 genes that increased the cell proliferation after tetraploidization, if knocked down by esiRNA. From the 431 genes that increased proliferation upon knockdown, 374 were selected and subjected to a re-screen. Of these 374 genes, we were able to confirm the results for 158 of the genes. A bioinformatics analysis of the 158 genes for which the phenotype were confirmed by the re-screen revealed a significant enrichment of genes involved in DNA replication, the canonical Wnt signaling pathway and in pathways linked to cancer. Among the latter, CCDC6 is particularly interesting, because its gene product is a target of the ATM kinase and an upstream regulator of the tumor suppressor 14-3-3σ. Moreover, by comparing the results of the primary screen with the data of the “Project Archilles”, which measured the proliferation in genome wide pooled-shRNA screens for 108 cancer cell lines, 18 genes were identified that are essential for the proliferation of cells after tetraploidization, as well as for the proliferation of cancer cell lines that derive from cancer types with a high incidence for chromosomal instability (CIN). Taken together, the presented data builds an excellent resource not only for elucidating how the arrest after tetraploidization is mediated, but also to identify novel potential therapeutic targets against tumors with CIN, which are frequently resistant to many of today’s anti-cancer therapies.