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Sieger, Boris (2015): Studies on polar cell wall growth and antibiotic susceptibility of Corynebacterium glutamicum. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

Corynebacterium glutamicum is a Gram positive soil bacterium with high industrial importance in ton scale production of amino acids. Apart from that, it becomes more and more important for medical studies, where it serves as model organism due to its close relation to bacteria causing several pathogens such as tuberculosis, diphtheria and leprosy. C. glutamicum, like Mycobacterium tuberculosis, has a distinct cell wall which is composed of a peptidoglycan layer (murein) with covalently bound polysaccharide layers that are capped with mycolic acids. In addition, both organisms have a polar cell wall synthesis machinery which is spatially regulated by DivIVA (Wag31 in M. tuberculosis). The present study shows that DivIVA regulates cell wall synthesis upon direct interaction with the lipid II flippase RodA. RodA determines morphology and growth in C. glutamicum and is localized to the poles and septa. The absence of rodA results in growth defects and cell shape alterations as well as altered lipid II proliferation of the poles (polar cell growth is sustained). DivIVA is furthermore involved in chromosome segregation upon direct interaction with the partitioning ParB protein, which binds to parS sites on the chromosome, thus tethering the replicated nucleoids to the cell poles. Interactions of DivIVA with ParB and RodA were identified in a synthetic in vivo protein-protein interaction assay where fluorescently labeled proteins of interest are expressed in E. coli cells and interaction is analyzed microscopically. A decisive improvement of this assay is the application of FRET, which is more sensitive and allows quantification of interaction. In order to test whether ParB and RodA compete for the same interaction site in DivIVA, we mapped interaction sites of both proteins. It turned out that ParB binds to a middle region of DivIVA, whereas RodA binds to the N-terminal domain of DivIVA where one lysine residue is essential for interaction. To fight bacterial infections, that cause thousands of casualties each year, it is mandatory to understand mechanisms in cellular processes, such as cell division and growth, to find new targets for antibiotic intervention. Unfortunately, bacteria are able to develop resistances against many antibiotics. The mycolic acid or arabinan layer and synthesis machinery are good candidates for new antibiotics. Amongst others, two of them have emerged as useful drugs against M. tuberculosis, ethambutol (EMB) and BTZ043. In this study, we investigated the modes of action and antibiotic susceptibility of C. glutamicum after EMB and BTZ043 treatment. We found that both antibiotics, which target the arabinan synthesis pathway, affect exclusively polar elongation growth, as demonstrated in different staining assays. Interestingly, only 10% of the cells were killed and cells in stationary phase were not affected by EMB or BTZ043. Moreover, we used a chromosomal DivIVA-mCherry fusion and found that DivIVA protein level is drastically increased. The cells show asymmetric recovery after treatment, in which one daughter cell acquires the excess DivIVA whereas the other daughter cell exhibits normal cell growth.

Abstract

Corynebacterium glutamicum ist ein Gram-positives Bodenbakterium mit großer industrieller Bedeutung für die Herstellung von Aminosäuren im Tonnenmaßstab. Des Weiteren bekommt es zunehmende Bedeutung für die medizinische Forschung, wo es aufgrund seiner engen Verwandtschaft zu den pathogenen Erregern von Tuberkulose, Diphtherie und Lepra als idealer Modellorganismus dient. Besonders die Zellwand von C. glutamicum hat große Ähnlichkeit zu der vieler pathogener Vertreter wie Mykobakterium tuberculosis. Sie besteht aus einer Peptidoglycan-Schicht (Murein), an der über weitere Polysaccharid-Schichten die charakteristischen Mycolsäuren gebunden sind. Darüber hinaus besitzen beide Organismen eine polare Zellwandsynthese, die von DivIVA (Wag31 in M. tuberculosis) räumlich reguliert wird. Die Rolle von DivIVA am Zellwachstum wurde vor Jahren erstmals beschrieben, jedoch war seine exakte Funktion bis zuletzt unbekannt. In dieser Studie wird erstmals die Funktion von DivIVA am polaren Zellwachstum durch Interaktion mit der Lipid II-Flippase RodA gezeigt. RodA beeinflusst die Morphologie und das Wachstum von C. glutamicum und wird von DivIVA an die Zellpole lokalisiert. Deletion von rodA resultiert in reduziertem Wachstum und veränderter Morphologie, sowie einer alternativen Lipid II Versorgung der Zellpole, da das polare Zellwachstum erhalten bleibt. DivIVA ist darüber hinaus an der Chromosomensegregation beteiligt, wo es direkt mit ParB interagiert, das über parS-Seiten an die replizierten Chromosomen bindet um sie an die Zellpole zu fixieren. Die Interaktionen zwischen DivIVA und ParB bzw. RodA wurden mit Hilfe eines synthetischen in vivo Assays identifiziert, worin die zu untersuchenden Gene an Fluorophore gekoppelt und in E. coli Zellen exprimiert werden. Somit lässt sich eine Co-Lokalisation nach individueller und Co-Expression der Fusionsproteine mikroskopisch analysieren. Eine entscheidende Verbesserung dieses Assays ist die Verwendung von FRET, das sensitiver ist und eine Quantifizierung der Interaktion ermöglicht. Um herauszufinden, ob ParB und RodA um die gleiche Bindungsstelle an DivIVA konkurrieren, wurden die Interaktionsdomänen beider Proteine ermittelt. Während ParB an eine mittlere Region in DivIVA bindet, bindet RodA an die N-terminale Domäne von DivIVA, in der ein Lysin-Rest für die Bindung essenziell ist. Für den Kampf gegen bakterielle Infektionskrankheiten, die jährlich tausende Todesfälle verursachen, ist es dringend notwendig zelluläre Mechanismen, beispielsweise der Zellteilung und des Wachstums, zu entschlüsseln um Targets für neue Antibiotika zu finden. Insbesondere die kontinuierliche Entstehung neue Resistenzen macht diese Aufgabe wichtiger denn je. Die Mykolsäureschicht und ihre Synthese sind vielversprechende Targets, da bisher nur wenige Antibiotika, wie Ethambutol (EMB) oder BTZ043, dagegen existieren. Wir haben die Wirkungsweise und antibiotische Suszeptibilität von C. glutamicum nach EMB und BTZ043 Behandlung untersucht. Beide Antibiotika, die in die Arabinogalactan-Synthese eingreifen, beeinflussen ausschließlich das polare Zellwachstum, wie in mehrerer Färbeassays gezeigt. Lediglich 10% der Zellen wurden getötet. Zellen, die sich in der stationären Phase befanden, wurde nicht beeinflusst. Darüber hinaus zeigte die Verwendung eines Stammes mit chromosomaler DivIVA-mCherry Fusion, dass das DivIVA Protein Level stark erhöht ist. Erholungsexperimente nach Antibiotikazugabe zeigten, dass die Zellen asymmetrisch reagieren, wobei eine Tochterzelle das überschüssige DivIVA übernimmt, während die andere Zelle normales Wachstum erfährt.