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Dittberner, Eva (2015): Vergleich von SISPA und random-PCR als sequenzunabhängige Amplifikationsmethoden zum schnellen und einfachen Nachweis unbekannter DNA-Viren. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Die Identifizierung unbekannter oder unvermuteter Viren in Probenmaterial stellt eine Herausforderung im Diagnostikalltag dar. Sequenzunabhängige molekulare Methoden können eine Ergänzung zu konventionellen Techniken bieten. Ziele dieser Arbeit waren die vergleichende Prüfung der sequence-independent single primer amplification (SISPA) und random-PCR als Vertreter sequenz-unabhängiger Methoden zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren und die Evaluierung ihrer Tauglichkeit als universell einsetzbare, schnelle, einfache und kostengünstige Alternativen für die Routinediagnostik. Als Modell diente das Equine Herpesvirus-1 (EHV-1), das in verschiedenen Probenmaterialien in ab-steigender Konzentration bei ansteigendem Fremd-DNA-Gehalt vorlag. Durch Schritte zur physikalischen und enzymatischen Virusanreicherung, sequenz-unabhängigen Amplifikation in Kombination mit der konventionellen Sanger-Sequenzierung und einem Datenbankabgleich sollte EHV-1 wiedergefunden werden. Trotz variabler Inhibition durch Gewebebestandteile stellte sich die Enzymbehandlung unter Einsatz einer geeigneten DNase als effektive Methode zur Elimination von Fremd-DNA heraus. Die Protektion viraler Nukleinsäuren durch Viruskapsid bzw. -hülle, die die Voraussetzung für eine erfolgreiche Durch-führung darstellte, konnte in verschiedenen Materialien gezeigt werden. Weiterhin wurde ein gradueller Verlust an viraler DNA im Verlauf beider Methoden festgestellt, der eine hohe Viruslast im Ausgangsmaterial nötig macht. Sowohl die SISPA als auch die random-PCR führten zu einem vergleichbaren Erfolg beim Virusnachweis in Zellkulturüberstand, infizierten Zellen und Lebergewebe, was für ihre Anwendbarkeit in zellarmen wie auch in zellreichen Proben spricht. Der entscheidende Faktor für den Erfolg beider Methoden schien dabei vor allem die Viruslast zu sein. Ein hoher Zellgehalt in der Probe beeinflusste die Methodik hin-gegen offenbar weniger stark. Der nachgewiesene sequenzunabhängige Charakter stellte aufgrund einer damit einhergehenden erhöhten Kontaminationsanfälligkeit einen Schwachpunkt in der Methodik der random-PCR dar. In dieser Arbeit ist es gelungen, SISPA und random-PCR erfolgreich zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren in Gewebe anzuwenden. Für die universelle Einsetzbarkeit zur Diagnostik unbekannter bzw. unvermuteter Viren sollten als nächstes geeignete Schritte der reversen Transkription und Zweitstrangsynthese erprobt werden.

Abstract

The discovery of unknown or unsuspected viruses poses a major diagnostic challenge. Sequence independent molecular strategies can be of great value in addition to conventional methods. The goals of this study were to compare two sequence independent methods, namely sequence-independent single primer amplification (SISPA) and random-PCR, for the detection of double-stranded DNA viruses and to evaluate their application in routine diagnostics as universal, fast, simple and inexpensive means of detection. This was tested on decreasing concentrations of equine herpes virus-1 (EHV-1), the virus being present in different types of samples displaying increasing amounts of DNA derived from both host and bacteria. The aim was to recover EHV-1 after physical and enzymatic steps for viral enrichment, sequence-independent amplification, conventional Sanger sequencing and database homology search. Despite variable tissue related inhibitory effects the enzymatic DNase treatment proved effective in eliminating non-viral DNA. The protection of viral nucleic acids by its capsid and envelope being a prerequisite for the successful application of both methods could be demonstrated in different types of samples. In the course of working with both methods a gradual loss of DNA was observed, thus requiring a high viral load in the original source. The recovery of virus in cell culture supernatant, infected cells as well as in liver tissue could be performed correspondingly by both SISPA and random-PCR methods. This indicates the general applicability in samples showing low and high levels of non-viral DNA. The viral load of the initial sample seemed to be the key factor for the successful application of both methods. In contrast to this, the amount of non-viral DNA apparently affected the methodology to a much lower extent than expected. In addition, the sequence-independent nature could be reproduced. However, this quality was associated with an increased susceptibility to contamination in case of the random-PCR method, which is a distinct limitation of this type of approach. This work demonstrates the successful application of SISPA and random-PCR for the detection of double-stranded DNA viruses in tissue samples. Further work should focus on appropriate steps for reverse transcription and second strand synthesis in order to provide a general tool for the detection of unknown or unsuspected viruses.