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Chang, Wai Ling (2014): Characterization of the protein import pathway in pea chloroplast. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

In order to sustain their structure and metabolism, chloroplasts and other plastid types must import the majority of their proteins from the cytosol across the envelope membrane. Translocation of these precursor proteins across the double envelope membrane is achieved by two multimeric complexes - the so-called TOC and TIC complexes (Translocon at the Outer envelope of Chloroplast and Translocon at the Inner envelope of Chloroplast, respectively). N-terminal transit peptides essential for import of the precursor proteins are cleaved after their entry into the stroma. It was thus far believed that all of the different cytosolic precursor proteins would enter the chloroplast through the same, jointly acting TOC/TIC machineries. Recent evidence, however, suggests that multiple, regulated import pathways exist in plastids that involve different import machineries. Different combinations of TOC and TIC proteins were shown to establish different import sites in Arabidopsis thaliana with specificity for either photosynthetic proteins (the general import pathway) or non-photosynthetic „housekeeping“ proteins. Moreover, numerous non-canonical import pathways such as the import of Tic32 and AtQORH mediated by the yet unknown novel import pathway and the import via the secretory pathway were shown to exist. Proteomics studies have revealed the presence of a large number of plastid proteins lacking predictable N-terminal transit sequences for import. The import mechanism for the majority of these proteins has not been determined yet. Examples of the transit sequenceless precursor proteins are the chloroplast envelope quinone oxidoreductase homologue, AtQORH and the chloroplast inner envelope protein 32, Tic32. Both proteins are imported into the inner plastid envelope membrane by a non-canonical pathway (Toc159- and Toc75-independent) and without any proteolytic cleavage. In the present study not only the import characteristic of nine tentative ‘non-canonical’ chloroplast precursor proteins but also the new interactions between these precursor proteins and the proteins at the organellar surfaces were analyzed. Moreover, a non-canonical precursor protein without the classical transit peptide, the iron superoxide dismutase (FSD1) could be identified. Biochemical crosslinking experiments revealed that FSD1 interacts with new members of the Toc159 family in pea, namely PsToc132 and PsToc120. Using deletion mutants as well as a peptide scanning approach, regions of the precursor protein, which are involved in receptor binding could be defined. These are distributed across the entire sequence; surprisingly only the extreme N-terminus as well as a C-proximal domain turned out to be essential for targeting and import. En route into the plastid FSD1 engages components of the general import pathway, implying that in spite of the ‘non-canonical’ targeting information and recognition by a specific receptor, this precursor protein follows a similar way across the envelope as the majority of plastid precursor proteins.

Abstract

Um ihre Struktur und ihren Metabolismus aufrechtzuerhalten, müssen Plastiden den Hauptteil ihrer im Zytosol synthetisierten Proteine importieren, was deren Transfer über die Hüllmembranen erfordert. Importapparate in der äußeren und inneren Hüllmembran, genannt TOC (Translocon at the Outer envelope of Chloroplast) und TIC(Translocon at the Inner envelope of Chloroplast), wurden identifiziert, die den Import von diesen plastidären Proteinen vermitteln. N-terminale Transitpeptide, die für den Import dieser Präproteine/Vorstufenproteine unerlässlich sind, werden nach deren Import im Stroma abgespalten. Bisher wurde angenommen, dass alle verschiedenen im Cytosol gebildeten Vorstufenproteine über die gleiche TOC/TIC Maschinerie in den Chloroplasten transportiert werden. Neuere Analysen belegen jedoch die Existenz verschiedener, regulierter Importwege, die unterschiedlichen Importapparate involvieren. So konnte in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana gezeigt werden, dass verschiedene Kombinationen von TOC und TIC Proteinen unterschiedliche Importwege bilden, die vorzugsweise entweder photosynthetisch aktive Proteine (der sogenannte ‚general import pathway‘) oder nicht-photosynthetisch aktive („housekeeping“) Proteine importieren. Weiterhin wurden zahlreiche nicht-klassische Importwege beschrieben, wie zum Beispiel der Import von Tic32 und AtQORH sowie der Import über das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat. Proteom-Analysen ergaben, dass zahlreiche in Plastiden lokalisierte Proteine keine prognostizierbaren N-terminalen Transitpeptide besitzen. Die Art und Weise ihres Imports ist bisher noch relativ unbekannt. Zwei Beispiele solcher Proteine sind ein in der plastidären Hüllmembran lokalisiertes quinone-oxidoreduktase-homolog, genannt AtQORH und eins der TIC Komponenten,Tic32. Dessen Import in die innere Hüllmembran erfolgte unabhängig von Toc159 und Toc75; zwei Komponenten des Standardproteinimportapparates, sowie ohne jede proteolytische Spaltung. Die vorliegende Arbeit analysierte sowohl die molekulare Importeigenschaften der transitpeptidelosen plastidären Vorstufenproteine als auch deren Interaktion mit Proteinen an den Organellenoberflächen. Darüber hinaus wurde „iron superoxide dismutase“ (FSD1) als eins der transitpeptidlosen plastidären lokalisierten Proteine identifiziert. Biochemische Crosslinking-Analysen zeigten, dass FSD1 mit den neuen Toc159-Homologen in Erbsen, PsToc132 und PsToc120 interagiert. Diese Daten lassen stark vermuten, dass das Vorhandensein mehrerer Toc159-Homologe, welcher an den unterschiedlichen TOC-Komplexen in Arabidopsis thaliana beteiligt sind, in Erbsen als möglich erschien. Um die Beteiligung des PsToc120 Rezeptorproteins bei der Erkennung und Sortierung der Vorstufenproteine im Cytosol zu untersuchen, wurde eine Kombination aus Deletion und eines Peptid-Arrays des FSD1-Proteins angewendet. Die Bindedomänen zwischen dem PsToc120 Rezeptorprotein und dem Vorstufenprotein, FSD1, wurden bestimmt. Dies ist zufällig über die gesamte Sequenz verteilt. Erstaunlicherweise sind nur der extreme N-Terminus sowie die C-proximale Domäne von FSD1 nötig um die Zielsteuerung und den Import in den Chloroplasten zu gewährleisten. Außerdem zeigte eine systematische Charakterisierung der Importwege von FSD1, dass FSD1, während seines Transports in den Chloroplasten mit den Bestandteilen des Standardproteinimportapparates interagiert. Dies weist darauf hin, dass der Transport von FSD1 in den Chloroplasten, trotz seines ungewöhnlichen N-terminalen Transitpeptids und die Nutzung von speziellen Rezeptorkomponenten, auf die gleiche Weise wie die Mehrzahl der plastidären Proteine erfolgt.