In situ Lokalisierung, PGPR-Effekt und Regulation des ipdC-Gens der Azospirillum brasilense Stämme Sp7 und Sp245 bei verschiedenen Weizensorten, sowie endophytische Kolonisierung durch Herbaspirillum sp. N3

Rothballer, Michael (2004): In situ Lokalisierung, PGPR-Effekt und Regulation des ipdC-Gens der Azospirillum brasilense Stämme Sp7 und Sp245 bei verschiedenen Weizensorten, sowie endophytische Kolonisierung durch Herbaspirillum sp. N3. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

The aim of this PhD thesis was to examine the endophytic colonization behavior of Azospirillum brasilense and Herbaspirillum sp. N3 on wheat roots. The application of the FISH method using species specific phylogenetic oligonucleotide probes and GFP tagging facilitated the detection of a differential colonization behavior by the A. brasilense strains Sp7 and Sp245 on three different wheat varieties (Triticum aestivum). For this purpose a confocal laser scanning microscope (CLSM) was used, which enabled three-dimesional analysis of bacterial colonization of the root. Especially GFP tagged strains were well suited for this application, as there was no pretreatment or sectioning of the root sample necessary. Strain Sp7 was only located on the root surface of all wheat cultivars, whereas strain Sp245 was also found inter- and intracellulary in the outer root cortex layers. There was no recognizable connection between the growth stimulating effect of the inoculum (PGPR-effect) and the localization of the bacteria. The most pronounced PGPR-effect could be observed with the Brazilian wheat cultivar, which seemed to gain greatest benefit of its partnership with A. brasilense due to a certain adaptation to the inoculum. As the production of the auxin IAA (indole-3-acetic acid) plays a major role in stimulating plant growth, the expression of the key gene ipdC (indole-3-pyruvate decarboxylase) was examined. For this, several methods were tested to generate a fusion of the ipdC promoter with a gfp or rfp reporter gene. Constructing a translational promoter fusion with the gfp variant mut3 on plasmid level made expression analyses possible. With this method the promoter region of strain Sp7 located directly upstream of the ipdC start codon was found to differ only in a few bases from strain Sp245. But further upstream a region of about 150 bases was identified in strain Sp245, which was missing in strain Sp7. For Sp245 two different fusions were constructed, which contained the Sp245 promoter region homologous to strain Sp7 and the whole promoter region of Sp245, respectively. With these constructs the importance of the promoter region only present in strain Sp245 for control and intensity of ipdC expression in A. brasilense Sp245 could be demonstrated. Additionally an induction of the corresponding ipdC promoter fusions of Sp7 and Sp245 was achieved when adding phenylalanine or tyrosine. Total promoter activity was higher in strain Sp7 than in strain Sp245, and ipdC expression appeared to be subject to a stricter control in strain Sp245. These results were confirmed, when the strains containing the promoter fusions were used as reporters for ipdC expression on wheat roots. A demonstration of the induction of the ipdC promoter by root exudates in situ was possible. Finally, isolate N3 from surface sterilized wheat roots was characterized in detail. According to the 16S rDNA sequence data the isolate was phylogenetically allocated to the genus Herbaspirillum. But a subsequent DNS-DNS hybridization ruled out, that the strain belonged to any of the known Herbaspirillum species. Thus, the isolate, which might represent a new species, was named Herbaspirillum sp. N3. A specific, 16S rRNA targeted probe was constructed, which facilitated the examination of wheat roots colonization by this bacteria using FISH. Additionally the strain was GFP tagged to enable the detection in uncut root material. By this, an unequivocal demonstration of the endophytic colonization by Herbaspirillum sp. N3 mainly within the intercellular spaces was possible.

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die endophytische Besiedlung von Weizenwurzeln durch Azospirillum brasilense und Herbaspirillum sp. N3 untersucht. Mittels FISH-Methode mit artspezifischen phylogenetischen Oligonukleotidsonden und GFP-Markierungen konnte bei den A. brasilense Stämmen Sp7 und Sp245 an drei verschiedenen Weizensorten (Triticum aestivum) ein unterschiedliches Besiedlungsverhalten gezeigt werden. Hierzu wurde ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop verwendet, mit dem eine dreidimensionale Aufklärung der bakteriellen Besiedlung der Wurzel möglich war. Für diese Anwendung eigneten sich besonders die GFP-markierten Stämme, da die Detektion in diesem Falle ohne Vorbehandlung oder Schneiden der Wurzel erfolgen konnte. Stamm Sp7 konnte bei allen Kultivaren nur an der Oberfläche lokalisiert werden, während Stamm Sp245 auch inter- und intrazellulär in den äußeren Kortexschichten der Wurzel gefunden wurde. Es war kein Zusammenhang zwischen der wachstumsstimulierenden Wirkung des Inokulums (PGPR-Effekt) und der Lokalisierung der Bakterien nachweisbar. Der stärkste PGPR-Effekt konnte bei dem verwendeten brasilianischen Weizenkultivar dokumentiert werden, das offensichtlich aufgrund einer gewissen Anpassung an das Inokulum den größten Nutzen aus der bakteriellen Besiedlung zu ziehen vermochte. Da für den PGPR-Effekt die Produktion des Auxins IES (Indol-3-Essigsäure) von zentraler Bedeutung ist, wurde die Expression des Schlüsselgens ipdC (Indol-3-pyruvat Decarboxylase) einer genauen Untersuchung unterzogen. Dazu wurden eine Reihe von Methoden getestet, um eine Fusion des ipdC-Promotors mit einem gfp- oder rfp-Reportergen zu erzeugen. Durch die Konstruktion translationaler Promotorfusionen mit der gfp-Variante mut3 auf Plasmidebene waren Expressionsanalysen möglich. Dabei ergab sich, dass sich die unmittelbar strangaufwärts des ipdC-Startcodons gelegene Promotorregionen des Stammes Sp7 nur in wenigen Basen von der des Stammes Sp245 unterscheidet. Allerdings schließt sich strangaufwärts an diesen Bereich bei Stamm Sp245 ein etwa 150 Basenpaare messender Abschnitt an, der bei Stamm Sp7 fehlt. Durch die Konstruktion von zwei verschiedenen Fusionen, die einmal den zu Stamm Sp7 homologen Bereich und einmal die gesamte Promotorregion von Sp245 beinhalteten, konnte eine maßgebliche Bedeutung dieser nur bei Stamm Sp245 vorhandenen Region für Kontrolle und Stärke der ipdC-Expression in A. brasilense Sp245 nachgewiesen werden. Außerdem erfolgte durch die Zugabe von Phenylalanin und Tyrosin eine Induzierung der entsprechenden ipdC-Promotorfusionen bei Sp7 und Sp245. Dabei lag die maximale Promotoraktivität bei Stamm Sp7 höher als bei Stamm Sp245. Bei letzterem unterliegt die ipdC-Expression jedoch einer strengeren Kontrolle. Diese Ergebnisse wurden beim Einsatz der Transkonjuganden als Reporterstämme der ipdC-Expression auf Weizenwurzeln bestätigt. Es konnte eine Induzierbarkeit des ipdC-Promotors durch die Wurzelexsudate in situ nachgewiesen werden. Schließlich wurde das von oberflächensterilisierten Weizenwurzeln gewonnene Isolat N3 einer genaueren Charakterisierung unterzogen. Anhand der 16S rDNS Sequenzdaten ließ sich das Isolat phylogenetisch der Gattung Herbaspirillum zuordnen, wobei eine nachfolgende DNS-DNS-Hybridisierung die Zugehörigkeit zu einer der bekannten Herbaspirillum Spezies ausschloss. Für das demnach als Herbaspirillum sp. N3 bezeichnete Isolat, das möglicherweise den Vertreter einer neuen Art darstellt, wurde eine spezifische, 16S rRNS gerichtete Sonde entwickelt, mit der die Besiedlung von inokulierten Weizensorten durch diesen Bakterienstamm mittels FISH untersucht werden konnte. Außerdem wurde eine GFP-Markierung zur Detektion in ungeschnittenem Wurzelmaterial vorgenommen. Dabei ließ sich eindeutig eine endophytische Besiedlungsweise von Herbaspirillum sp. N3 demonstrieren, wobei das Bakterium bevorzugt in Interzellularräumen der Wurzel lokalisiert war.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Azospirillum brasilense, PGPR, Gfp, FISH, ipdC
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 2. Februar 2004