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Prell-Schicker, Caroline (2015): Transkriptionelle Regulation des Schlaganfall-Risikogens: HDAC9 durch den E2F3/Rb1-Komplex. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie
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Abstract

In westlichen Industrieländern stellt Schlaganfall eine der häufigsten Todesursachen dar und ist hauptursächlich für körperliche Behinderung. In einem hohen Maße kann Schlaganfall auf genetische Faktoren zurückgeführt werden, weshalb kürzlich eine genomweite Assoziationsstudie (GWAS) in der METASTROKE-Kohorte für ischämischen Schlaganfall durchgeführt wurde. Hierbei konnte die Chromosomenregion 7p21.1 als bisher stärkster Risikolokus für atherosklerotischen Schlaganfall identifiziert werden. Diese Region umfasst das Ende des HDAC9-Gens und den benachbarten intergenischen Bereich stromaufwärts der Gene TWIST1 und FERD3L. Der Haupt-SNP rs2107595 kolokalisiert mit einem DNase I-hypersensitiven Bereich sowie Histonmodifikations-Hotspots und könnte somit genregulatorische Konsequenzen besitzen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführte Genexpressionsstudien in humanen Blutzellen ergaben eine Dosis-abhängige Korrelation der HDAC9 mRNA-Spiegel mit dem rs2107595-Risikoallel. HDAC9 gehört zur Familie der Histondeacetylasen, die v.a. bei der Transkription eine wichtige Rolle spielen. Das rs2107595-Risikoallel verändert ein bioinformatisch vorhergesagtes Bindemotiv für E2F-Transkriptionsfaktoren, das beim häufigen Allel intakt ist. Untersuchungen der transkriptionellen Kapazität dieser Bindungsstelle zeigten eine erhöhte Aktivität des häufigen Allels im Vergleich zum Risikoallel. Zur Identifizierung dafür verantwortlicher DNA-interagierender Proteine wurde in Kollaboration mit dem Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried eine proteomweite Analyse von SNPs (PWAS) durchgeführt. Hierbei wurden die Proteine E2F3, E2F4, TFDP1 und Rb1 mit präferentieller Bindung an das häufige rs2107595-Allel identifiziert. E2F/TFDP/Rb-Komplexe sind ein zentraler Bestandteil des G1/S-Übergangs im Zellzyklus und regulieren somit die Zellproliferation. In gain- und loss-of-function-Experimenten von E2F3, E2F4 und der Rb-Proteinfamilie in humanen Zelllinien mit verschiedenen Genotypen für rs2107595 konnte eine unterschiedliche Regulation der HDAC9-Expression beobachtet werden. Nach Zellzyklus-Synchronisation konnten erhöhte HDAC9-Spiegel im Zeitraum der aktiven Phase von E2F3 gezeigt werden, was den Befund einer Regulation durch den E2F3/TFDP1/Rb1-Komplex stützt. Ein erhöhtes Risiko für Schlaganfall könnte also durch eine Risikoallel-vermittelte Störung dieses genregulatorischen Mechanismus entstehen.

Abstract

Stroke is one of the major causes of death and physical disability in developed countries and can be attributed to a considerable extent to genetic factors. In a recent genome-wide association study (GWAS) in the METASTROKE cohort for ischemic stroke, the chromosome 7p21.1 region comprising the tail end of the HDAC9 gene and the adjacent intergenic region upstream of the TWIST1 and FERD3L genes was identified as the so far strongest risk locus for large vessel stroke. The lead SNP rs2107595 co-localizes with a DNase I hypersensitivity cluster and histone modification hotspots indicating an involvement in gene regulatory mechanisms. Gene expression studies in human blood cells performed in this thesis revealed a dosage-dependent correlation of the rs2107595 risk allele with HDAC9 mRNA levels. HDAC9 is a member of the family of histone deacetylases which play an important role during transcription. The rs2107595 risk allele disrupts a bioinformatically predicted binding site for E2F transcription factors, which is intact when the common allele is present. Analyses of the transcriptional capacity of this binding site showed elevated activity for the common allele compared to the risk allele. To identify the responsible DNA-interacting proteins, a proteome-wide analysis of SNPs (PWAS) was performed in collaboration with the Max-Planck-Insitute for Biochemistry, Martinsried. The proteins E2F3, E2F4, TFDP1 and Rb1 were identified as preferential interactors of the common allele. E2F/TFDP/Rb complexes are central components of the G1/S-boundary in the cell cycle and regulate its progression. We applied gain- and loss-of-function approaches for E2F3, E2F4 and the Rb protein family members in human cell lines with different rs2107595 genotypes and showed a differential regulation of HDAC9 expression. Upon cell cycle synchronization we observed increased HDAC9 levels correlating with the active phase of E2F3, supporting the finding of a regulation through the E2F3/TFDP1/Rb1 complex. Increased stroke susceptibility might arise from a risk allele-mediated interruption of this gene-regulatory mechanism.