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Reiger, Matthias (2014): Regulation der Autoinduktoren von Vibrio harveyi. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

In Vibrio harveyi induzieren die drei Autoinduktoren (AIs) Z-3-Aminoundec-2-en-4-on CAI 1, N-(3-Hydroxybutyryl)-D-Homoserinlakton HAI 1 und der Furanosylboratdiester AI 2 die Quorum Sensing (QS) Regulationskaskade. So werden unter Anderem Biolumineszenz, Biofilmbildung und Exoproteaseaktivität beeinflusst. Um die Sensorik der QS Kaskade zu verstehen, wurde die Expression verschiedener QS-Zielgene im Wildtyp untersucht. Im Vergleich mit einer AI-negativen Mutante zeigte sich, dass nicht die Zelldichte sondern die Konzentration der verschiedenen AIs und deren Verhältnisse zueinander die QS-Signalkaskade steuern. Beides verändert sich in Abhängigkeit von der Medien-zusammensetzung und erlaubt so die Modulation z.B. der Biolumineszenz (Kapitel 2.1.). Die extrazelluläre AI-Konzentration im Medium hängt entscheidend von der Produktion sowie dem Transport ab. Während HAI-1 aufgrund seiner chemischen Eigenschaften frei aus der Zelle diffundiert, müssen CAI-1 und AI-2 aktiv über die Membran transportiert werden. In Escherichia coli beeinflusst die Deletion des möglichen Transporters YdgG die extrazelluläre AI-2 Konzentration. Im Rahmen dieser Arbeit konnte bioinformatisch mit YhhQ ein zusätzlicher potentieller Exporter identifiziert werden. Bindestudien an beiden Proteinen, zeigten eine mikromolare Affinität für YhhQ jedoch nicht für YdgG. Im Gegensatz dazu ist die extrazelluläre AI-2-Konzentration der ΔydgG/ΔyhhQ Doppelmutante im Vergleich zu den Einzeldeletionen um 4 µM reduziert. In vivo Parallelstudien am YhhQ Ortholog in V. harveyi allerdings, lassen redundante Transportmechanismen vermuten. In diesem Zusammenhang könnte z.B. auch eine durch Phagen vermittelte Zelllyse eine Rolle spielen (Kapitel 2.2.1.). Unabhängig von Produktion und Export kann die externe AI-Konzentration auch durch aktive Reduktion in Form von Import und intrazellulärem Abbau kontrolliert werden. In diesem Zusammenhang sagte die AG Bischofs einen AI-2-Importer vorher und dessen Vorhandensein wurde im Verlauf dieser Promotion experimentell validiert (Kapitel 2.2.2.). Eine weitere Möglichkeit des sogenannten Quorum Quenching ist der Abbau von Acylhomoserinlaktonen wie HAI-1 durch Acylasen und Laktonasen. Bioinformatische Analysen aus der AG Streit identifizierten die fünf potentiellen Laktonasen VIBHAR_02708, VIBHAR_03213, VIBHAR_06370, VIBHAR_06736 und VIBHAR_06900. Jedoch, liegt nach intensiven Untersuchungen am Wildtyp und den „Laktonase“-Mutanten der Schluss nahe, dass es in V. harveyi keinen aktiven HAI-1 Abbau gibt. Vielmehr handelt es sich bei VIBHAR_06370 um eine β-Laktamase, die eine natürliche Ampicillinresistenz vermittelt (Kapitel 2.3.). Im Gegensatz dazu, kodieren VIBHAR_02708 und VIBHAR_03213 die Typ II Glyoxalasen GloB und GloC und tragen damit zur Detoxifikation von Methylglyoxal nicht nur in V. harveyi sondern auch in E. coli bei (Kapitel 2.4.).

Abstract

In Vibrio harveyi three autoinducers (AIs) Z-3-aminoundec-2-en-4-one CAI-1, N-(3-hydroxybutyryl)-D-homoserine lactone HAI-1 and the furanosylboratdiester AI-2 induce the quorum sensing (QS) regulatory cascade. Thus, among other phenotypes, bioluminescence, biofilm formation and exoprotease activity are affected. In order to understand the sensing mechanism of the QS cascade, the expression of various QS target genes in the wild type was examined. Compared to an AI-negative mutant it was obvious that not the cell density but the concentration of the different AIs and their interplay control the QS signaling cascade. Both changed depending on the media composition and thus allow the modulation of e.g. bioluminescence (Chapter 2.1.). The extracellular AI concentration in the medium depends crucially on the production and transport. Whereas HAI-1 diffuses freely out of the cell due to its chemical properties, CAI-1 and AI-2 have to be actively transported across the membrane. In Escherichia coli, the deletion of the putative transporter YdgG affects the extracellular AI-2 concentration. In this work an additional potential exporter YhhQ was identified bioinformatically. AI 2 binding studies on both proteins, showed a micromolar affinity for YhhQ but did not exhibit affinity for YdgG. In contrast to this, the extracellular concentration of the AI-2-ΔydgG/ΔyhhQ double mutant compared to the single deletion mutants is 4 µM lower. Parallel in vivo studies on the YhhQ ortholog in V. harveyi, however, suggest redundant transport mechanisms. In this context, cell lysis could also be involved. This is why the role of phage mediated lysis should be investigated (Chapter 2.2.1.). Regardless of production and export, the external AI concentration can also be controlled actively by import and subsequent degradation. In this context, the AG Bischofs predicted an AI-2 importer, which existence has been validated experimentally in the course of this PhD thesis (Chapter 2.2.2.). Another way of action of the so-called quorum quenching is the degradation of acylhomoserinlactones as HAI-1 by acylases and lactonases. Bioinformatics analysis of the AG Streit identified five potential lactonases VIBHAR_02708, VIBHAR_03213, VIBHAR_06370, VIBHAR_06736 and VIBHAR_06900. However, intensive studies on the wild type and the "lactonase" mutants showed that there is no active degradation of HAI-1 in V. harveyi. VIBHAR_06370 is a β-lactamase that conveys a natural ampicillin resistance (Chapter 2.3.). In contrast, VIBHAR_02708 and VIBHAR_03213 encode the type II glyoxalases GloB and GloC and thus contribute to the detoxification of methylglyoxal not only in V. harveyi but also in E. coli (Chapter 2.4.).