Generierung und genotypische Untersuchung eines Ciprofloxacin-resistenten Bacillus cereus Stammes und Entwicklung von real-time-PCR-Schnelltests zum Nachweis von Resistenzen gegen Ciprofloxacin in Bacillus anthracis

Hübner, Anika (2014): Generierung und genotypische Untersuchung eines Ciprofloxacin-resistenten Bacillus cereus Stammes und Entwicklung von real-time-PCR-Schnelltests zum Nachweis von Resistenzen gegen Ciprofloxacin in Bacillus anthracis. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

Die gebräuchliche Therapie gegen Milzbrand besteht aus der Gabe von Antibiotika. Als Therapie der Wahl gilt hierbei das Fluorochinolon Ciprofloxacin. Resistenzen gegen dieses Antibiotikum wurden bei B. anthracis in vivo noch nicht, in vitro jedoch im Rahmen mehrerer Studien beschrieben. Es existieren herkömmliche Resistenztests, wie der Gradientendiffusions- oder der Mikrodilutionstest, welche bei einer Milzbranderkrankung genutzt werden können. Diese nehmen jedoch aufgrund der kulturellen Anzucht in einem Labor der Schutzstufe 3 vor der Durchführung des Tests ein bis zwei Tage Zeit in Anspruch. Um diese Zeitspanne zu verkürzen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Schnelltests entwickelt. Diese basieren auf einer real-time-PCR Methode, mit welcher Ciprofloxacin-Resistenz verursachende Punktmutationen (= SNPs), nachgewiesen werden. Im ersten Abschnitt dieser Studie wurde der B. cereus Stamm ATCC10987 resistent gegen Ciprofloxacin generiert. Aufgrund der Dual-Use-Research-of-Concern-Problematik wurde dieser, wenig pathogene, aber genotypisch sehr nah mit B. anthracis verwandte, BSL-2-Organismus verwendet. Die Resistenzbildung erfolgte durch natürliche Selektion, indem der B. cereus Wildtyp mehrfach auf Ciprofloxacin-haltigen Agar-Platten, welche eine steigende Konzentration des Antibiotikums enthielten, angezüchtet wurde. Es folgte eine Sequenzierung der Quinolone Resistance Determinig Region (= QRDR), bestehend aus den Genen gyrA, gyrB, parC und parE, von neun B. cereus Mutanten, welche CIP-Resistenzen entwickelt hatten. Eine der Mutanten besaß einen SNP im Gen gyrA an Stelle 254 mit einer Mutation der Base Cytosin in ein Thymin. Solche SNPs stellen eine mögliche Ursache der Resistenz gegen Fluorochinolone dar. Acht der B. cereus Mutanten besaßen jedoch keine SNPs in der QRDR. Die Ursache für deren Resistenz wird in der erhöhten Funktion von Effluxpumpen vermutet. Im zweiten Teil der Studie wurden die Schnelltests entwickelt. Es wurden mehrere Protokolle für die beiden real-time-PCR Methoden TaqMan® und MeltMAMA (= Melt Analysis of Mismatch Amplification Mutation Assays) erstellt und getestet. Der Vergleich beider Methoden wertete den TaqMan® als die Methode der Wahl für die gesetzte Zielstellung. Daraufhin wurden für acht bekannte Ciprofloxacin-Resistenzen auslösende SNPs TaqMan®-Protokolle entwickelt. Im Abschluss wurden diese durch Versuche mit verschiedenen B. anthracis Stämmen, dem B. cereus ATCC10987 Wildtyp und seinen Mutanten, synthetisch hergestellten Templates, die als Mutationskontrollen genutzt wurden, sowie verschiedenen Bacillus Spezies hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität erprobt. Es wurden acht TaqMan® Protokolle erarbeitet, welche SNPs in der QRDR von B. anthracis nachweisen und somit eine schnelle Diagnose vieler Ciprofloxacin-resistenter Stämme gewährleisten. Der Einsatz dieser Schnelltests zusätzlich zu den herkömmlichen Empfindlichkeitstests gibt die Möglichkeit eine optimale Therapie von Milzbrandinfektionen in einem verkürzten Zeitraum zu gewährleisten.

Abstract

Common therapy against anthrax typically is based on the antibiotic ciprofloxacin, a fluoroquinolone. Resistances against these gyrase-inhibitors may occur in this Gram-positive bacterium and have been described in the literature. To test for resistances in a B. anthracis strain from patients with acute anthrax infections resistance-assays such as the antimicrobial diffusion gradient or micro-dilution methods are applied. However, these kinds of culture-dependent diagnostics require up to two days for completion. Therefore, we developed a more rapid method involving eight real time PCR assays to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) leading to resistance against ciprofloxacin in B. anthracis. Because of dual-use issues associated with B. anthracis being a BSL-3 organism we created ciprofloxacin resistant strains utilizing the less pathogenic, very close relative species B. cereus ATCC10987. DNA-sequences especially of the fluoroquinolone resistance determining (gene) regions (QRDR) are highly conserved among B. cereus and B. anthracis. B. cereus ATCC10987 which is a BSL2-pathogen was made ciprofloxacin-resistant via natural selection of resistant strains by cultivating the bacteria on agar plates containing increasing concentrations of ciprofloxacin. We identified SNPs in the QRDR of gyrase and type IV topoisomerase genes. These QRDR comprise the genes gyrA, gyrB, parC and parE which represent the targets of ciprofloxacin. Mutations in these genes are known to cause resistance against ciprofloxacin. Some of the mutants did not contain such SNPs. Efflux-pumps are assumed to be the source of their resistance. In the development of the diagnostic PCR-assays the two real time methods, (i) TaqMan® or (ii) Melt Analysis of Mismatch Amplification Mutation Assays (MeltMAMA) were tested. TaqMan® proved to be the method of choice after comparison. TaqMan®-assays for the SNPs were developed. Finally these assays were performed with different B. anthracis strains, the B. cereus ATCC10987 wildtype, the selected mutants and synthetic templates used as mutation-control to determine sensitivities and specificities. Eight TaqMan®-assays, which detect SNPs in the QRDR of B. anthracis, were developed. They ensure a quick identification of many ciprofloxacin-resistant strains. The additional use of these rapid tests in addition to the common resistance-assays enable an optimal therapy of anthrax in a shorter period of time.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Bacillus anthracis, Antibiotika-Resistenzen
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 12. Juli 2014
• 1. Bericht­erstatter:in: Straubinger, Reinhard