Logo Logo
Hilfe
Kontakt
Switch language to English
Seidel, Susanne (2014): Nanoliter-droplet thermophoresis for biomedical applications. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik
[img]
Vorschau
PDF
Seidel_Susanne.pdf

8MB

Abstract

Specific interactions of biomolecules are central to cellular processes, drug discovery and immunodiagnostics. Such biological binding events are quantifiable via thermophoresis, the directed molecule movement driven by a temperature gradient. Biomolecule thermophoresis can be induced by infrared laser heating and analyzed using fluorescence. The objective of this thesis was to enhance and optimize these all-optical measurements, regarding instrumentation, assay design and biomedical applications. In the first part, a novel measurement device and approach are presented, which cut down sample consumption 50-fold compared to established capillary thermophoresis. Instead of capillaries, analysis was performed in 10 nl-sample droplets transferred into standard 1536-well plates with a non-contact liquid handler (Labcyte). To prevent evaporation, the aqueous sample droplets were stabilized in an oil-surfactant mix. Temperature induced effects in this water-in-oil system were experimentally characterized and the results agreed with numerical simulation. The system’s applicability for biomolecular interaction analysis was confirmed with a DNA aptamer. The achieved miniaturization and the easy-to-handle multi-well plate format promote automated high-throughput screens. Besides aptamers, proteins should also be measurable very well when judging from the application depth of capillary measurements. This versatility of protein investigation via capillary thermophoresis is demonstrated in the second part. Successful experiments were not only conducted in diverse liquids including crude cell lysate, but also for binding partners with a broad range of molecular weight ratios. Affinities between protein and protein, protein and peptide, as well as protein and small molecule were determined with high accuracy. Further flexibility arises from the herein presented label free approach which utilizes protein intrinsic UV fluorescence. It is caused by aromatic amino acids with tryptophan being the major intrinsic fluorophore. This approach exempts from the need to attach a dye, which saves time and excludes labeling artifacts. The wide variety of proteins that can be analyzed with thermophoresis also includes anti-bodies. Two applications of such thermophoretic immunoassays are introduced in the third part. Firstly, the therapeutically interesting antibody MCPR3-7 was assessed. MCPR3-7 binds proteinase 3 (PR3), the major autoimmune target in granulomatosis with polyangiitis. Thermophoresis allowed to quantified MCPR3-7’s affinity and selectivity for different PR3 forms. In addition, it revealed that the antibody interferes with the complexation of PR3 and alpha-1-proteinase inhibitor (alpha-1PI). Secondly, a diagnostic autocompetition assay is described, which directly determines affinity and concentration of disease related biomarkers. It was applied for autoantibodies against the cardiac β1-adrenoceptor found in patients suffering from dilated cardiomyopathy. To detect these autoantibodies, the small peptide COR1 mimicking the adrenoceptor’s dominant epitope served as an artificial antigen. This tracer was labeled with a red-fluorescent dye, which ensured selectivity for measurements directly in untreated human blood serum. The results prove that thermophoresis is a valuable tool to characterize antibodies including those of diagnostic value and those with a therapeutic potential. Taken together, the presented innovations in assay design and the novel nl-droplet approach can be expected to considerably widen the application spectrum of thermophoresis in fundamental research, industrial drug discovery and clinical laboratory diagnostics.

Abstract

Spezifische Interaktionen von Biomolekülen sind von zentraler Bedeutung für zelluläre Prozesse, die Entwicklung neuer Medikamente und die Immundiagnostik. Solche biologischen Bindungsvorgänge lassen sich mittels Thermophorese, der gerichteten Molekülbewegung entlang eines Temperaturgradienten, quantifizieren. Die Thermophorese von Biomolekülen kann durch Infrarotlaser-Heizen induziert und mittels Fluoreszenz analysiert werden. Die Weiterentwicklung dieses optischen Verfahrens bezüglich des Messinstruments, des Versuchsdesigns und der biomedizinischen Anwendungen war das Ziel der vorliegenden Dissertation. Im ersten Teil wird eine neuartige Technik vorgestellt, die den Probenverbrauch verglichen mit etablierten Kapillarmessungen um den Faktor 50 verkleinert. Statt in Kapillaren wurde in 10 nl-großen Probentropfen gemessen, die mit einem kontaktfreien Liquid-Handler (Labcyte) in eine 1536-Well-Platte übertragen wurden. Zum Schutz vor Verdunstung wurden die Tropfen in eine Öl-Tensid-Schicht transferiert. Temperaturinduzierte Effekte in diesem Wasser-in-Öl-System wurden experimentell charakterisiert, wobei die Ergebnisse durch numerischen Simulationen bestätigt wurden. Dass sich die Methode für biomolekulare Interaktionstests eignet, wurde anhand eines DNA-Aptamers belegt. Die Miniaturisierung und die einfache Handhabung der Multi-Well-Platten ermöglichen automatisierte Hochdurchsatz-Screens. Neben Aptameren sollten sich auch Proteine sehr gut untersuchen lassen, wenn man von einer ähnlichen Anwendungsbreite wie bei Kapillarmessungen ausgeht. Auf derartige Proteinuntersuchungen mittels Kapillarthermophorese wird im zweiten Teil eingegangen. Analysen wurden nicht nur in diversen Puffern und sogar in rohem Zelllysat durchgeführt, sondern auch mit unterschiedlichsten Bindungspartnern. So wurden Affinitäten zwischen Protein und Protein, Protein und Peptid, sowie Protein und niedermolekularer Verbindung mit hoher Genauigkeit bestimmt. Thermophoresetests gewinnen durch das in dieser Arbeit präsentierte, markierungsfreie Verfahren zusätzlich an Flexibilität. Es basiert auf der intrinsischen UV-Fluoreszenz von Proteinen, die auf aromatische Aminosäuren, hauptsächlich Tryptophan, zurückzuführen ist. Somit müssen Proteine nicht mehr mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, was Zeit spart und Artefakte ausschließt. Der dritte Teil behandelt die Quantifizierung von Antikörpern. Thermophoretische Immunassays wurden für zwei biomedizinische Fragestellungen eingesetzt. Zunächst wurde der aus therapeutischer Sicht interessante Antikörper MCPR3-7 untersucht. Er ist gegen Proteinase 3 (PR3) gerichtet, das Hauptepitop autoimmuner Antikörper bei der granulomatösen Polyangiitis. Mithilfe der Thermophorese wurde sowohl die Affinität von MCPR3-7 für verschiedene PR3-Formen quantifiziert, als auch gezeigt, dass der Antikörper die Komplexierung von PR3 und alpha-1-Proteinaseinhibitor (alpha-1PI) stört. Ferner wird ein diagnostisches Autokompetitionsverfahren vorgestellt, das gleichzeitig die Affinität und die Konzentration von Biomarkern in humanem Blutserum quantifiziert. Autoantikörper gegen den kardialen β1-Adrenozeptor, die mit der dilatativen Kardiomyopathie assoziiert sind, wurden mithilfe des kurzen Peptides COR1 analysiert, das das dominante Epitop nachstellt. Die Ergebnisse belegen, dass die Thermophorese ein wertvolles Werkzeug für die Antikörpercharakterisierung ist. Zusammengefasst lassen die vorgestellten Neuerungen eine umfangreiche Erweiterung des Anwendungssprektrums der Biomolekülthermophorese in der Grundlagenforschung, der industriellen Wirkstoffsuche und der klinischen Labordiagnostik erwarten.