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Neuner, Johanna (2014): Untersuchung der strukturellen Plastizität von adult-geborenen Neuronen und deren Synapsen im Riechkolben eines Mausmodells der Parkinsonschen Erkrankung in vivo, Investigation of the structural plasticity of adult-born neurons and their synapses in the olfactory bulb of a mouse model of Parkinson disease in vivo. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

Das Protein α-Synuklein (α-SYN) spielt eine kritische Rolle in der Pathogenese des Morbus Parkinson. So wird angenommen, dass die Aggregation dieses Proteins für die Degeneration von dopaminergen Nervenzellen des Mittelhirns und den damit verbundenen motorischen Symptomen verantwortlich ist. Während dieser pathophysiologische Zusammenhang allgemein anerkannt ist, bleibt der Einfluss von α-SYN auf nicht-motorische Systeme des Gehirns und somit auf prämotorische Symptome, wie die häufig früh im Krankheitsverlauf auftretende Riechstörung, relativ unerforscht. Der Riechkolben bildet die erste zentrale Stelle für die Verarbeitung von Geruchseindrücken und stellt eine von wenigen Gehirnregionen mit einer außergewöhnlich hohen neuronalen Plastizität dar, da er kontinuierlich mit neuen adult-geborenen Nervenzellen versorgt wird. Selbst im erwachsenen Gehirn - wenn auch in geringerer Anzahl - wandern in diese Region neuronale Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone (SVZ) und dem rostralen migratorischen Strom (RMS) ein, die in lokale Interneurone ausdifferenzieren und in bestehende Netzwerke integrieren. Dabei bilden neue Nervenzellen funktionelle Synapsen mit bereits vorhandenen Neuronen aus und tragen zur Riechwahrnehmung bei. Aufgrund seiner Funktion an der Synapse könnte α-SYN insbesondere einen Einfluss auf die Reifung und Integration von adult-geborenen Neuronen mit möglichen pathophysiologischen Konsequenzen für den Geruchssinn haben. Um die Plastizität im Riechkolben von transgenen α-SYN Mäusen zu untersuchen, eignet sich besonders die Zwei-Photonen-Mikroskopie, da mit dieser Technik neuronale Strukturen bis hin zu einzelnen Synapsen im intakten neuronalen Netzwerk der lebenden Tiere über mehrere Tage bis Monate verfolgt werden können. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Riechkolben des verwendeten Mausmodells histopathologisch und funktionell untersucht. Die transgenen A30P α-SYN Mäuse wiesen pathologische α-SYN Ablagerungen in Mitralzellen auf, und zeigten Störungen in der feinen Geruchsdiskriminierung. Anschließend wurde eine Subpopulation von adult-geborenen Neuronen, dopaminerge periglomeruläre Neurone, die bekannterweise sensibel auf α-SYN reagieren, genetisch markiert. Mittels intravitaler Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde der neuronale Umsatz, der kontinuierliche Neugewinn und Verlust an dopaminergen Nervenzellen, in A30P α-SYN und Wildtypmäusen über einen Zeitraum von 2,5 Monaten beobachtet. Dabei wurde kein Unterschied in der Anzahl an Zellen gemessen, die ihren Zielort im Riechkolben erreichen, und möglicherweise in das Netzwerk integrieren. In den transgenen α-SYN Mäusen wiesen diese Neurone jedoch eine signifikant verkürzte Überlebensspanne auf, was insgesamt in einem Nettoverlust an Neuronen in der Glomerulärzellschicht resultierte. Interessanterweise waren von dem Zelluntergang vor allem adult-geborene Neurone, die erst kürzlich ins Netzwerk integrierten, betroffen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die frühen Schritte der neuronalen Eingliederung und Differenzierung in einen dopaminergen Phänotyp in A30P α-SYN Mäusen nicht beeinträchtigt sind, sondern vielmehr ihr längerfristiges Fortbestehen und Überleben in dem olfaktorischen Netzwerk. Möglicherweise trägt diese instabile Integration und damit gestörte Homöostase von funktionellen neuen Neuronen zu der verminderten Fähigkeit der Geruchsdiskriminierung in A30P α-SYN Mäusen bei. Um die der Riechstörung zugrunde liegenden pathophysiologischen Veränderungen weiter aufzuklären, wurde im zweiten Teil der Arbeit der Einfluss von aggregations-anfälligem A30P α-SYN auf die strukturelle und funktionelle Entwicklung von Körnerzellen, die 95% der adult-geborenen Neurone darstellen, untersucht. Während die biologischen Eigenschaften und physiologischen Mechanismen von Körnerzellen mit ihrer Rolle bei der Verarbeitung von olfaktorischen Eindrücken weitestgehend aufgeklärt sind, ist nur wenig über die synaptische Funktion und strukturelle Plastizität dieser adult-geborenen Neurone unter pathologischen Bedingungen bekannt. Deshalb wurde im Folgenden die Funktionsweise von adult-geborenen Körnerzellen an dendrodendritischen Synapsen mit stabilen Mitralzellen, die pathologisch verändertes α-SYN akkumulieren, genauer charakterisiert. Diese synaptischen Verbindungen sind von wesentlicher Bedeutung für die Geruchsdiskriminierung. Dazu wurden die gesamten dendritischen Bäume einzelner Nervenzellen mittels zeitlich kodierter lentiviraler Transduktion markiert und chronisch mikroskopiert, wobei einzelne dendritische Spines über mehrere Wochen wiederholt aufgesucht und in hoher Auflösung aufgezeichnet wurden. Adult-geborene Körnerzellen in A30P α-SYN Mäusen waren durch eine reduzierte Komplexität des Dendritenbaumes und eine erniedrigte Spineplastizität, bedingt durch einen verminderten natürlichen Zugewinn an dendritischen Spines während der kritischen Phase der Nervenzellreifung, gekennzeichnet. Dieses Spinedefizit blieb in ausgereiften und integrierten Körnerzellen bestehen. Funktionell waren die unvollständig gereiften Körnerzelldendriten durch eine signifikant verminderte elektrische Kapazität und eine gesteigerte intrinsische Erregbarkeit und Reaktionsfreudigkeit auf depolarisierende Eingangssignale gekennzeichnet, während der Spineverlust mit einer verminderten Frequenz von erregenden postsynaptischen Miniaturströmen (mEPSCs) korrelierte. Die in dieser Arbeit beschriebenen, durch A30P α-SYN vermittelten, Veränderungen der adult-geborenen Neurone wirken sich folglich störend auf die Verarbeitung von olfaktorischen Inputs aus, und könnten deshalb von pathophysiologischer Relevanz für das Verständnis von Riechstörungen in frühen Stadien des Morbus Parkinson sein. Um diesen Veränderungen therapeutisch entgegenzuwirken, wurde den transgenen Mäusen über mehrere Monate eine Substanz mit anti-aggregativen Eigenschaften verabreicht. Diese zeigte keinen therapeutischen Effekt auf das Überleben und die Spinedichte von adult-geborenen Neuronen in A30P α-SYN Mäusen. Insgesamt liefert diese Arbeit neue, fundamentale Einblicke in die A30P α-SYN-abhängige Regulation der strukturellen Plastizität als ein pathophysiologisches Korrelat für Morbus Parkinson.

Abstract

The protein α-synuclein (α-SYN) plays a critical role in the pathogenesis of Parkinson disease where it is responsible for the degeneration of dopaminergic midbrain neurons and related motor symptoms. Although this function of noxious α-SYN is well recognized, its impact on non-motor circuits of the brain and associated pre-motor symptoms, such as the early olfactory deficit, remains elusive. The olfactory bulb constitutes the first central hub for the processing of odour inputs and represents one of a few brain structures with an extremely high neuronal plasticity, as it is constantly supplied with adult-born neurons. Throughout adulthood - even though in smaller numbers -, this area receives neuronal precursors from the subventricular zone (SVZ) via the rostral migratory stream (RMS) which differentiate into local interneurons and integrate into the existing networks. Thereby, new neurons establish functional synapses with pre-existent nerve cells and contribute to odour perception. Due to its function at the synapse, α-SYN could thus potentially influence the maturation and integration of adult-born neurons with a notable impact on olfactory performance in Parkinson disease. Two-photon-microscopy is a suitable tool to investigate the neuronal plasticity in the olfactory bulb of transgenic α-SYN mice, because it allows the chronic observation of neuronal structures up to the resolution of single synapses in the intact neuronal network of living mice over a period of days to months. In the first part of the present work, the olfactory bulb of the used mouse model was tested for neuropathological and functional alterations. A30P α-SYN mice showed deposition of pathologically-modified α-SYN in mitral cells, and were impaired in fine odour discrimination. Subsequently, one well-known vulnerable subpopulation of adult-born neurons, the dopaminergic periglomerular neurons, was genetically labelled. Using intravital two-photon imaging, the dynamic process of neuronal turnover, the steady gain and loss of neurons, was followed over a period of 2.5 months in transgenic A30P α-SYN and wild-type mice. The results revealed no difference in the number of cells that reach, and possibly integrate into, the glomerular layer in the olfactory bulb. However, in α-SYN transgenic mice these new neurons have a significantly shortened survival, resulting in an overall reduction in the addition of neurons to the glomerular layer over time. Of note, this neuronal loss specifically targets those cells which have been recently integrated in the network. Such data demonstrates that early stages of incorporation and differentiation into dopaminergic neurons are not affected in transgenic A30P α-SYN mice. Rather, it is their long-term consistency and survival within the olfactory bulb network which is defective. Hence, the unstable integration and impaired homeostasis of functional new neurons likely contribute to the odour discrimination deficits observed in mutant A30P α-SYN mice. To elucidate the pathological changes underlying the olfactory deficit, in the second part of the work, the influence of aggregation-prone A30P α-SYN on the structural and functional development of granule cells, which depict over 95% of all adult-born neurons, was examined. While impressive progress has been made towards interpreting the basic biology and physiological mechanisms of granule cells and their role in processing of olfactory inputs, little is known about the synaptic functions and plasticity of these adult-born neurons under pathological conditions. Thus, the impact of aggregation-prone A30P α-SYN on the functionality of dendrodendritic synapses with the stable mitral cells, which accumulate pathological α-SYN, was characterized in detail, as these connections are essential for odour discrimination. To this end, the full dendritic trees of neurons were first labelled by time-coded lentiviral transduction and then traced chronically, with single dendritic spines being re-located over several weeks and imaged at high resolution. In A30P α-SYN mice, adult-born granule cells showed a retarded development, being characterized by reduced branching of dendrites and diminished dendritic spine plasticity with reduced gain of new spines. The impairments of spines were especially evident during the critical phase of maturation and integration of new neurons into the existing bulbar circuits, and were detected as persistent trait also in mature adult-born neurons. Functionally, retarded dendrites translate into reduced capacitance with enhanced intrinsic excitability and responsiveness of granule cells to depolarizing inputs, while the loss of spines correlates with decreased frequency of mEPSCs. These A30P α-SYN-induced alterations of adult-born neurons are likely to interfere with the processing of olfactory inputs and thereby contribute towards the olfactory deficit of early Parkinson disease. To counteract these specified changes therapeutically, transgenic mice were administered a compound with anti-aggregative properties over several months. This compound showed no therapeutic effect on the survival and dendritic spine density of adult-born neurons in A30P α-SYN mice. Together, this work offers new fundamental insights into the α-SYN-dependent regulation of the structural plasticity as a pathophysiological correlate for Parkinson disease.