Vergleichende Analyse der Gerstmann-Straeussler-Scheinker-Syndrom-assoziierten Mutation A117V mit der neuen pathogenen Mutation G114V des humanen Prion-Proteins in vivo und in vitro

Schmalzbauer, Ruediger (2003): Vergleichende Analyse der Gerstmann-Straeussler-Scheinker-Syndrom-assoziierten Mutation A117V mit der neuen pathogenen Mutation G114V des humanen Prion-Proteins in vivo und in vitro. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Besides its fully translocated form, the prion protein (PrP) can exist in two transmembrane forms (NtmPrP and CtmPrP), which span the lipid bilayer in either direction. Certain mutations in the membrane-spanning segment of PrP have been shown to increase synthesis of CtmPrP and result in neurodegeneration. One of these mutations is A117V, which is associated with Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome (GSS). Sequence-analysis of patients showing neurological disorders revealed a new point-mutation (G114V) in the central region of PrP. The age of affected individuals is strikingly low; the clinical symptoms overlap with GSS as well as Creutzfeldt-Jakob disease. Due to their close vicinity within the transmembrane domain of PrP and misincorporation of valine in both cases, PrP G114V and PrP A117V were investigated in comparative studies. Both mutations caused a similar cellular phenotype strongly differing from wild type PrP. Characteristics included reduced expression of surface PrP as well as increased intracellular accumulation. Besides differences in the cellular localization, a slowed-down metabolism resulting in prolonged transit to the cell surface was detectable. Long-term expression of mutant PrP caused strong agglutination and decline of human neuroblastoma cells that might be due to the increased synthesis of transmembrane forms of mutant PrPs as verified using a cell-free topology assay. When proteasomal degradation was perturbed, PrP G114V and PrP A117V revealed enhanced proteinase K resistance and increased detergent insolubility. The close similarities displayed by both mutations point to a common pathological mechanism that differs from other prion diseases, thus arguing for a distinct class of disease.

Abstract

Die vererbbaren Formen humaner Prionkrankheiten repräsentieren etwa 10 % der gesamten Erkrankungsfälle. In allen bislang untersuchten Fällen konnten Punktmutationen oder Insertionen im Prion-Protein-Gen des Menschen (PRNP) nachgewiesen werden. Auch die in dieser Arbeit erstmals beschriebene neue PRNP-Mutation G114V läßt bei Betrachtung der Stammbäume bislang erfasster Familien auf einen hereditären Hintergrund schließen. Auffällig ist das zum Teil sehr junge Alter der mit dieser Mutation behafteten Patienten (20-25 Jahre) sowie die Ähnlichkeiten der klinischen Symptome zum Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS). Eine der bereits bekannten PRNP-Mutationen, welche zu GSS führt, ist A117V. Diese Mutation liegt, ebenso wie G114V, im zentralen, hochkonservierten Bereich des Prion-Proteins (PrP), welcher nicht nur eine der physiologischen Spaltstellen, sondern auch die postulierte transmembrane Domäne von PrP beinhaltet. Bislang über A117V erhobene Daten waren hauptsächlich auf die Beschreibung des klinischen Bildes beschränkt und erlaubten keine gesicherten Rückschlüsse über den auf zellbiologischer Ebene zu Grunde liegenden pathogenen Mechanismus. Aufgrund der Ähnlichkeit der Mutationen G114V und A117V wurden in der vorliegenden Arbeit unterschiedliche in vivo- und in vitro-Modellsysteme etabliert, um vergleichende Analysen dieser Mutationen gegen Wildtyp-PrP (wt-PrP) durchführen zu können. In murinen und humanen Zellkulturmodellen wurden neben der Synthese sowie der Degradation der Proteine auch ihre biochemischen Eigenschaften untersucht. Durch Generierung von GFP („green fluorescent protein“)-PrP-Chimären und deren Analyse mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie konnten Informationen über den intrazellulären Transport dieser mutierten Proteine gewonnen werden. Für beide Mutationen wurde ein vergleichbarer, stark vom Wildtyp abweichender zellulärer Phänotyp nachgewiesen. Als Charakteristika dieses Phänotyps konnten unter anderem eine verringerte Expression der mutierten Proteine auf der Zelloberfläche bei gleichzeitig verstärkter Lokalisation im Endoplasmatischen Retikulum sowie ein verlangsamter Transport durch die Zelle identifiziert werden. Darüber hinaus führten beide Mutationen zur Entstehung erhöhter Mengen an Proteinase K-resistentem PrP, welches sich durch spezifische Inhibierung des proteasomalen Degradationspfades im Zytosol anreichern ließ. Auslöser hierfür ist wahrscheinlich der mittels in vitro-Simulierung der Proteinsynthese nachgewiesene erhöhte Anteil transmembran orientierter Moleküle. Es konnte auch gezeigt werden, dass sich G114V- und A117V-PrP von PrPSc, der infektiösen Isoform des Prionproteins, unterscheiden. Dies deutet darauf hin, dass beide Mutationen innerhalb der familiären Prionkrankheiten eine eigene Gruppe von Krankheiten repräsentieren, welche sich durch Nicht-Übertragbarkeit auszeichnet – eine Eigenschaft, welche für die Mutation A117V bereits bestätigt wurde. Die bei den Mutationen G114V und A117V detektierte Anhäufung an zytosolischem PrP stellt möglicherweise ein Charakteristikum sämtlicher Prionkrankheiten dar, welches sich entsprechend der unterschiedlichen Weiterprozessierung dieses zytosolischen PrPs in verschiedenen Phänotypen manifestiert.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: prion protein, inherited mutations, transmembrane topology, cytosolic accumulation
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 17. Dezember 2003