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Schermuly, Julia (2014): Etablierung eines in vitro Systems zur Infektion von B- und T-Zellen mit dem Virus der Marek’schen Krankheit, Establishment of an in vitro culture system for Marek’s Disease Virus infection of B- and T-cells. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Die Marek’sche Erkrankung (MD) ist weltweit eines der bedeutendsten Probleme in der Geflügelindustrie und verantwortlich für erhebliche wirtschaftliche Schäden. Die MD wird durch ein lymphotropes und strikt zell-assoziiertes α-Herpesvirus (MDV) verursacht, das immunsuppressiv wirkt und regelmäßig T Zelltumore induziert. B- und T-Zellen sind die primären Zielzellen des MDV in vivo. In B-Zellen kommt es zu einer lytischen Infektion und zum massiven Untergang der infizierten Zellen. Dagegen wird eine latente Infektion primär in CD4+ αβTCR+ T-Zellen beobachtet, welche nach Reaktivierung des Virus auch transformieren und Lymphome bilden können. Bis heute basieren alle Untersuchungen zur MD Pathogenese entweder auf in vivo Versuchen oder aber auf Zellkultursystemen, die mit Fibroblasten oder Nierenzellen arbeiten. Ein in vitro Infektionssystem für B- und T-Zellen, den primären Zielzellen des Virus, konnte bis heute nicht etabliert werden. Ursächlich hierfür war das Fehlen geeigneter Zellkultursysteme für diese Zellen, die ex vivo nur eine sehr kurze Überlebenszeit und einen schnellen apoptotischen Zelltod zeigen. Fortschritte in der aviären Immunologie haben zur Charakterisierung zahlreicher Zytokinen und Wachstumsfaktoren geführt, die B- und T-Zellen in vitro aktivieren, zur Proliferation anregen und erhöhte Überlebensraten induzieren. Diese Zytokine wurden in der vorliegenden Arbeit genutzt, um neue Kultursysteme für Hühner-Lymphozyten zu etablieren, mit deren Hilfe in vitro MDV Infektionsmodelle für B- und T Zellen aufgebaut werden konnten. Die erfolgreiche Infektion der Zellen wurde mit Hilfe genetisch modifizierten MDV-Reporterviren (MDV RB-1B UL47GFP und RB-1B MeqGFP-UL47RFP) nachgewiesen. Die aus der Milz, dem Blut und der Bursa Fabricii isolierten B-Zellen wurden mit löslichem chCD40L stimuliert und mit MDV RB-1B UL47GFP infizierten Fibroblasten co-kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion konnten infizierte B-Zellen durch die Expression von UL47GFP durchflusszytometrisch identifiziert werden. Die Infektion wurde zusätzlich durch die zytoplasmatische Färbung der MDV-Proteine ICP4 und gB bestätigt. Der Anteil infizierter Bursa-B-Lymphozyten stieg von 2,5% am ersten Tag nach der Infektion (p.i.) bis auf ca. 15% an Tag 4 p.i. Vergleichbare Werte wurden auch für B-Zellkulturen aus der Milz und dem Blut gefunden. Die durchflusszytometrische Charakterisierung der infizierten Zellpopulation erfolgte mit Hilfe zahlreicher Hühner-spezifischer monoklonaler Antikörper. Infizierte B-Zellen sind chBu1+ und zeigen einen distinkten Phänotyp sowie eine intermediäre Zellgröße. Für die weitere Charakterisierung wurden infizierte und nicht infizierte Bursa-B-Zellen durchflusszytometrisch sortiert (> 95% Reinheit) und Mikroarray basierten Genexpressionsanalysen unterzogen. Auch T-Zellen aus der Milz, dem Blut und dem Thymus konnten nach αVβ1-TCR (TCR-2) Stimulation auf dieselbe Weise mit RB-1B MeqGFP-UL47RFP infiziert werden. Der Hauptteil der infizierten T-Zellen zeigte einen CD4+ αVβ1-TCR+ Phänotyp, allerdings fanden sich auch einige infizierte CD8+ T-Zellen. Durch die alleinige Expression von MeqGFP oder die gleichzeitige Expression von UL47RFP und MeqGFP konnten die infizierten Thymozyten in eine latent und eine zytolytisch infizierte Population unterteilt werden. Während die zytolytisch infizierte Population primär aus B-Zellen und CD8+ T-Zellen bestand, waren die latent infizierten T-Zellen zum Großteil CD4+ T Zellen. Erstmals gelang es in dieser Arbeit die Übertragung des Virus von der B-Zelle auf die T Zellen durch Co-Kultivierung mit durchflusszytometrisch sortierten infizierten B Zellen direkt nachzuweisen. Darüber hinaus konnten aus Langzeitkulturen infizierter Thymozyten vier lymphoblastoide Zelllinien (JS1 –JS4) isoliert werden. Alle vier Linien zeigten ein homogenes, lymphoblastoides Erscheinungsbild und waren CD4+, αVβ1-TCR+, MHC I+ und MHC II+. Dieser Phänotyp entspricht exakt dem von in vivo transformierten T Zelllymphomen. Das in dieser Arbeit etablierte Infektionssystem ist das erste Kultursystem, mit dem eine reproduzierbare und effiziente MDV Infektion von Lymphozyten in vitro erreicht wird. Es spiegelt die verschiedenen Phasen des natürlichen Infektionszyklus wider. Damit eröffnet sich erstmals ein Weg, die Interaktion von B-Zellen und Virus, bzw. T-Zellen und Virus detailliert und zu definierten Zeitpunkten zu analysieren. Hervorzuheben ist, dass die hier beschriebenen Methoden nicht nur verbesserte Untersuchungsmöglichkeiten bieten, sondern auch dazu beitragen können, die Zahl der bisher notwendigen Tierversuche in der MDV-Forschung deutlich zu reduzieren.

Abstract

Marek’s disease (MD) is a leading problem in the poultry industry causing significant economic losses worldwide. MD is caused by the Marek’s disease virus (MDV), an alphaherpesvirus that induces immunosuppression and T-cell lymphomas. B- and T lymphocytes are the primary target cells of the virus in vivo and B-lymphocytes undergo cell death in the early cytolytic phase of infection. Latent MDV infection is primarily established in CD4+ αβTCR T-cells, which can also be transformed after virus reactivation leading to lymphoma formation. MDV research has either used in vivo infections or utilized fibroblast and kidney cell cultures for in vitro studies. Thus far, no in vitro infection systems for B- and T-cells, the primary target cells of MDV have been established due to the rapid apoptotic cell death of cultured primary lymphocytes. Recent progress in avian immunology has led to the identification of numerous cytokines promoting survival, proliferation and activation of cultured chicken B- and T-cells. These cytokines were utilized to establish new lymphocyte culture systems and in vitro B- and T cell infection models using the genetically modified MDV reporter strains MDV RB-1B UL47GFP and RB-1B MeqGFP-UL47RFP. B-cells isolated from spleen, bursa and blood were cultured in the presence of soluble chCD40L for extended periods of time and successfully infected by co-culturing with MDV infected chicken embryo cells (CEC) as demonstrated by GFP expression. Infection was confirmed by cytoplasmic staining with monoclonal antibodies (mabs) to the viral proteins ICP4 and gB. Infection rates increased from 2.5 to 15% in bursal lymphocyte cultures between day one and day four post infection and similarly in blood and spleen derived B cells. Cell surface staining with a range of mabs revealed that infected cells represented a subpopulation of chBu1+ cells with a unique phenotype and an intermediate cell size. Further phenotypic characterization of these cells was achieved by microarray based gene expression analysis on infected and no infected B cells enriched to more than 95% purity by fluorescence activated cell sorting. In addition, T-cells isolated from spleen, blood and thymus activated by cross-linking of the αVβ1-TCR (TCR-2) could be infected in the same way. The vast majority of infected T lymphocytes were CD4+ whereas only a small number of CD8+ cells were positive for viral genes. Expression of MeqGFP or MeqGFP plus UL47RFP indicated that latent and lytic infections occurred in T-cell cultures. T-cell infection was not only achieved with infected CEC but also with infected B-cells enriched through fluorescence activated cell sorting. By maintaining activated thymocytes for up to five weeks without further stimulation, four transformed lymphoblastoid cell lines termed JS1 to JS4 were successfully established in vitro. These cell lines represented CD4+, αVβ1-TCR+, MHC I+ and MHC II+ cells, thus reflecting the typical phenotype of MDV lymphomas observed in chickens. For the first time, this work describes the establishment of a reproducible and efficient in vitro infection system which precisely reflects the in vivo life cycle of MDV. This system will help to shed new light on the interaction between MDV and its target cells by providing lymphocytes at defined stages of infection at high purity. Of equal importance, it should help to reduce the number of animal experiments by providing a reliable in vitro alternative.

Abstract