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Perera, Natascha (2014): Investigation of the biochemistry and function of neutrophil serine protease 4 (NSP4). Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

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Abstract

Serine proteases in cytoplasmic granules of neutrophils (NSPs), namely neutrophil elastase, cathepsin G (CG) and proteinase 3, have been under intense investigation for several decades. They are mainly known for their role in intracellular killing of pathogens and are also increasingly recognized as key regulators of innate immune responses. In 2009, I identified a fourth serine protease in neutrophils that has been completely overlooked and neglected so far. The aim of this thesis was an in-depth biochemical and functional characterization of this novel serine protease 4 (NSP4) of human neutrophils. Using monoclonal antibodies to NSP4, the distribution of NSP4 in normal human tissues was studied. NSP4 was observed only in neutrophils and neutrophil precursors of the bone marrow. The content of NSP4 in neutrophil lysates was about 20-fold lower compared to CG. Nevertheless, NSP4 was found to be released into the supernatant upon neutrophil activation. NSP4 could be further identified as a novel azurophil granule protein of neutrophils by Western blot analyses of subcellular fractions. For the functional analysis, the production and yield of recombinant NSP4 was clearly improved using different expression systems and DNA construct modifications. The proteolytic specificity was analyzed using E. coli peptide libraries, mass spectrometry and several synthetic peptide libraries. All these analyses clearly revealed an arginine specificity for NSP4. Consistent with this, NSP4 was strongly inhibited by heparin-accelerated antithrombin and C1 inhibitor and, with lower efficacy, by α1-proteinase inhibitor (α1PI). The data allowed me to generate an NSP4-specific α1PI variant that was shown to form covalent complexes with all NSP4 of neutrophil lysates and supernatants of activated neutrophils. This finding strongly indicated that NSP4 is fully processed and stored as an already activated enzyme in azurophil granules. In addition, dipeptidyl peptidase I (DPPI) was identified as the activator of NSP4 in vivo, as DPPI deficiency resulted in complete absence of NSP4 in a Papillon-Lefèvre patient. Analysis of cell-based calcium assays revealed that proteinase-activated receptor-2 may represent a potential natural substrate of NSP4. So far, NSP4-deficient mice did not show an abnormal phenotype under clean housing conditions. Activation of isolated neutrophils by phorbol esters or immune complexes was also not impaired. This study establishes NSP4 as the only arginine-specific pre-activated serine protease stored in azurophil granules of neutrophils that may fullfil a quite distinct, supportive role in neutrophil responses to tissue damage and bacterial infections.

Abstract

Die Granula-assoziierten Serinproteasen der Neutrophilen, genannt Neutrophilen-Elastase, Cathepsin G (CG) und Proteinase 3, werden bereits seit über 30 Jahren intensiv erforscht. Sie sind hauptsächlich für ihre Funktion bei der intrazellulären Degradation von pathogenen Keimen bekannt. Außerdem werden sie zunehmend als wichtige Regulatoren der angeborenen Immunantwort angesehen. Im Jahr 2009 identifizierte ich eine vierte Serinprotease in Neutrophilen, die bis dahin komplett übersehen wurde. Das Ziel dieser Arbeit war eine ausführliche Untersuchung der Biochemie und Funktion dieser neuen Serinprotease 4 (NSP4) in humanen Neutrophilen. NSP4 konnte in immunhistochemischen Analysen normaler Gewebe nur in Neutrophilen und deren Vorläuferzellen im Knochenmark nachgewiesen werden. Die Menge von NSP4 im Gesamtzelllysat von Neutrophilen war 20-fach geringer als die von CG. Dennoch konnte ich nachweisen, dass NSP4 von aktivierten Neutrophilen sezerniert wird. In subzellulären Neutrophilen-Fraktionen war NSP4 in erster Linie mit azurophilen Granula assoziiert. Die Produktion und Ausbeute rekombinanter, aktiver NSP4 wurde mithilfe verschiedener DNA-Konstrukte und Expressionssysteme deutlich verbessert. Für die Bestimmung der proteolytischen Spezifität wurden E. coli Peptidbibliotheken, Massenspektrometrie und synthetische Peptidbibliotheken eingesetzt. Alle Ergebnisse ergaben eindeutig eine Arginin-Spezifität für NSP4. NSP4 wurde sehr gut von Heparin-Antithrombin, C1 Inhibitor und mit geringerer Effizienz von α1-Proteinase-Inhibitor (α1PI) blockiert. Die Ergebnisse ermöglichten die Herstellung einer NSP4-spezifischen α1PI Variante, die nachweislich mit der gesamten NSP4 aus Neutrophilen-Zelllysat und aus Überständen aktivierter Neutrophilen einen kovalenten Komplex bildete. Dies war ein klarer Hinweis für die Speicherung und Sekretion der NSP4 als aktive Endoprotease. Außerdem konnte ich zeigen, dass NSP4 in vivo von Dipeptidylpeptidase I (DPPI) aktiviert wird, da in einem Papillon-Lefèvre Patienten ohne funktionelle DPPI auch NSP4 nicht nachweisbar war. Intrazelluläre Kalziummessungen in HaCaT-Zellen ergaben, dass der Proteinase-aktivierte Rezeptor-2 ein mögliches natürliches Substrat für NSP4 sein könnte. In einer Pathogen-freien Reinraumumgebung zeigten NSP4-defiziente Mäuse bislang noch keinen Phänotyp. Auch die Aktivierung isolierter Neutrophilen durch Phorbolester oder Immunkomplexe war nicht beeinträchtigt. In dieser Arbeit gelang es mir, die erste aktive Arginin-spezifische Serinprotease (NSP4) in azurophilen Granula von Neutrophilen zu identifizieren. Wegen ihres Vorkommens in allen sequenzierten Genomen höherer Vertebraten könnte NSP4 eine wichtige Rolle bei der Steuerung und Verstärkung Neutrophilen-abhängiger Immunantworten zukommen.

Verfügbare Versionen dieser Dissertation

  • Investigation of the biochemistry and function of neutrophil serine protease 4 (NSP4). (Veröffentlicht am 24. Mrz. 2014 09:01) [Oben angezeigt]