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Heilkenbrinker, Uta (2014): Wirkungsweise des Bacillus cereus Enterotoxins Nhe: Bedeutung der Komplexbildung zwischen NheB und NheC. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper (mAk) gegen die C-Komponente des Non-haemolytic Enterotoxin (Nhe)-Komplexes von Bacillus cereus sowie deren Einsatz zur Analyse der Rolle des NheC im Hinblick auf die Wirkungsweise von Nhe. NheC wurde in Escherichia coli rekombinant exprimiert und mittels Immunaffinitätschromatographie aufgereinigt. Nach Überprüfung durch SDS-PAGE und Quantifizierung mittels SYPRO® Ruby Protein Gel Färbung wurde das gereinigte Toxin als Immunogen eingesetzt. Nachfolgend konnten drei mAk vom IgG-Subtyp (mAk 2G8, 1E12, 2F10) und ein mAk vom IgM-Subtyp (mAk 3D6) gegen NheC hergestellt werden. Die Charakterisierung der mAk erfolgte mittels Enzymimmuntest (EIA), Western Immunblot und Immunfluoreszenzmikroskopie. Bei Verwendung eines indirekten EIAs erlaubten die mAk den sensitiven Nachweis von rNheC im unteren Nanogrammbereich (Nachweisgrenze 10 – 15 ng/ml). Untersuchungen zur Spezifität der mAk innerhalb des Nhe-Komplexes mittels indirekten EIAs und Western Immunblots zeigten, dass die mAk 2G8 und 1E12 substantielle Kreuzreaktionen mit der strukturverwandten NheB-Komponente aufweisen. Dies konnte durch Epitopanalysen und kompetitive Bindungstests noch bestätigt werden. Während die mAk 2G8, 1E12 und 3D6 mit allen überprüften B. cereus-Stämmen reagierten, weist das von dem mAk 2F10 erkannte Epitop eine stammspezifische Variabilität auf. In Zellkulturtests war keiner der vier mAk in der Lage die zytotoxische Aktivität des Nhe-Komplexes zu neutralisieren. Demgegenüber gelang es mit allen mAk mittels Immunfluoreszenz erstmals die direkte Bindung von NheC an die Zielzelle darzustellen. Unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums gegen NheC als Fangantikörper und der vier mAk gegen NheC als Nachweisantikörper wurden hochempfindliche Sandwich-EIAs für den Nachweis von gereinigtem NheC entwickelt. In natürlichen B. cereus-Überständen konnten jedoch nur geringe Mengen (< 10 %) des theroretisch vorhandenen NheC nachgewiesen werden. Die auf diesen Ergebnissen basierende Hypothese, dass NheC in Lösung an NheB gebunden vorliegt, konnte zunächst in artifiziellen Systemen bestätigt werden. Mangels SDS-Stabilität der NheB-NheC-Komplexe, erfolgte der Nachweis mittels intermolekularem Cross-Linking und Dot Blot-Analysen. Durch Kombination des NheC-spezifischen mAk 3D6 als Fangantikörper und des HRP-gekoppelten mAk 1E11 gegen NheB als Nachweisantikörper konnte ein spezifischer NheC/B-Sandwich-EIA zum Nachweis von NheB-NheC-Komplexen in B. cereus-Kulturüberständen etabliert werden. Zur Analyse der Funktion der NheB-NheC-Komplexe wurde zum einen die Komplexbildung mit der Zytotoxizität verglichen, und zum anderen per Durchflusszytometrie deren Zellbindung mittels NheB-Quantifizierung (durch mAk 1E11) bestimmt. Fazit ist, dass scheinbar sowohl eine definierte Menge an NheB-NheC-Komplexen, als auch ausreichend freies NheB vorhanden sein müssen, damit effiziente Zellbindung und Zytotoxizität von Nhe gewährleistet sind.