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Schiffels, Daniel (2013): Design, characterization and functionalization of DNA materials. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik
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Abstract

DNA wird seit einigen Jahren zur Herstellung von Strukturen mit Nanometer Präzision genutzt. Mittels der am häufigsten verwendeten Techniken, “Tile” und “ DNA Origami”, wurden verschiedenste DNA Objekte wie unter anderem DNA Kristalle, DNA Nanotubes, gebogene und verdrehte Zylinder und selbst komplexe 3D Strukturen hergestellt. Aufgrund der einzigartigen Kontrolle über die räumliche Anordnung von DNA Molekülen wird DNA Nanotechnologie heute in verschiedensten Forschungsgebieten wie struktureller Biologie, Nanomedizin, Einzel-Molekül Detektion oder Plasmon-Forschung verwendet. In dieser Arbeit wird systematisch die Biege-Steifigkeit (Persistenz Länge) von DNA Nanotubes (HX-Tubes) als Funktion des Umfangs untersucht. Dazu wurden mikrometer- weite thermische Nanotube Fluktuationen mittels Fluoreszenz Mikroskopie analysiert (A,B). Zusätzlich wurden intrinsische und thermische Nanotube Verdrehungen durch Anbindung von Gold-Nanopartikeln (AuNP) und Transmissions Elektronen Mikroskopie (TEM) sicht- bar gemacht (C). Aus diesen Messungen ergibt sich, dass die Peristenz Länge sich pro- portional zum Flächenträgheitsmoment des Nanotube Querschnitts verhält, intrinsische Verdrehungen nur auftreten, wenn sie durch die DNA Sequenzen vorgegeben sind und dass thermische Verdrehungen u ̈ber sehr viel kürzere Distanzen als die Persistenz Länge auftreten. Des weiteren wurde ein DNA Nanotube Elastizitäts-Modell hergeleitet, das Ver- formungen von doppelstängiger DNA sowie von Cross-Overn berücksichtigt und gezeigt, dass alle Messungen in guter Übereinstimmung mit dem Modell sind. Um ein besseres Verständnis für den Zusammenhang zwischen Persistenz Länge und dem Aufbau von DNA Nanotubes auf der Ebene einzelner DNA Moleküle zu gewinnen wurden die thermischen Verbiegungen von verschiedenen sechs-Helix-Tubes mit unterschiedlichen DNA Architekturen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass das Anordnen von mehreren Cross-Overn innerhalb einer Tube Querschnittsfläche sowie die Verringerung der Dichte von DNA Cross-Overn die Persistenz Länge verringert. Die Ergebnisse werden im Rahmen des zuvor hergeleiteten Elastizitäts Modell diskutiert. Es wurden verschiedene Strategien zur Herstellung von gebogenen und verdrehten DNA Nanotubes entwickelt. Biegung und Drehung wurden durch gezielte Einfügung oder Auslassung von Basenpaaren, speziell programmierten Faltungswegen, oder spezielle Anordnung von komplementären DNA Sequenzen innerhalb der Nanotubes kontrolliert. Nanotube Konturen wurden mittels TEM, Rasterkraftmikroskopie (AFM), UV-Absorption, sowie stochastischer optischer Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) charakterisiert. Die Mes- sungen zeigen, dass gebogene Nanotubes meist geschlossene Ringe bilden und Nanotubes mit Biegung und Drehung helix-förmig sind (D). Es wird gezeigt, dass Anbindung des organischen Farbstoffs Cy3 an einen oder mehrere DNA Stränge der HX-Tubes ebenfalls zur Ausbildung von Helix-förmigen Nanotubes führt (E). Ganghöhe und Radius der Nanotubes mit Cy3 Anbindung wurden systematisch in Abhängigkeit der Cy3-Bindungsposition gemessen und das Ergebnis mit einem einfachen Cy3-DNA Bindungsmodell verglichen. Des weiteren wurden die optischen Eigenschaften von Cy3 Moleku ̈len, gebunden an HX-Tubes mittels Fluoreszens-Polaristations-Mikroskopie (FPM) und Fluoreszenslebensdauer Messungen untersucht. Es wurde ein Zusammenhang zwischen Anisotropie (gemessen mittels FPM) und der Orientierung der Cy3 Dipol Achse hergeleitet. Die beobachtete Anisotropie entspricht in diesem Modell einem Winkel von ca. 60° zwischen Cy3-Dipol und DNA Achse. Es wird gezeigt, dass die Ausbildung von fluoreszenten Silber Clustern, bestehend aus wenigen Atomen (Ag-DNA) innerhalb von einzelsträngigen “DNA hairpins” an der Oberfläche von DNA Nanotubes stattfinden kann (F). DNA Nanotubes mit Ag-DNA Clustern sind fluoreszent und konnten mittels Fluoreszenz Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Als Nebenprodukt der Ag-DNA Synthese wurde Aggregation von DNA Nanotubes beobachtet. Es wurden zwei neue Methoden zur Weiterentwicklung der DNA Origami Methode untersucht: 1) Kristallisierung von rechteckigen DNA Origami Strukturen zu 1D Ketten und 2D Gittern (G) und 2) Anbindung von “Tiles” an einer DNA origami “Schablone”. Die Faltungs-Ausbeute beider Strategien wurde mittels Gel Elektrophorese, TEM und AFM charakterisiert. Schließlich wird im letzten Kapitel eine Sammlung von Matlab Programmen vorgestellt, die benutzt wurden um DNA Nanotube Kontouren automatisch aus Bild Daten auszulesen, Persistenz Länge zu bestimmen, polarisierte Fluoreszenz Bilder auszuwerten und DNA Sequenzen zu generieren.

Abstract

In recent years it has been demonstrated, that the sequences of a set of DNA molecules can be specifically programmed to drive their self-assembly into a predesigned nanoscale shape with nanometer precision. The two main techniques, “tiled” assembly and “DNA origami” have been used for the construction of DNA crystals, DNA nanotubes as well as single- and multi-layer DNA objects including cuboids, curved and twisted bundles and even complex 3D geometries such as hollow containers. Because of this unique spatial control, today, DNA nanotechnology is actively used in a wide range of research areas such as structural biology, nanomedicine, single-molecule detection and plasmonics. We systematically measure the bending stiffness (persistence length) of DNA nanotubes (HX-tubes) as function of their circumference by analyzing micron-scale thermal fluctu- ations using fluorescence video microscopy (A, B). We further characterize intrinsic and thermal HX-tube twist by direct visualization of gold nano particles (AuNP), bound to specific positions of the tubes by electron microscopy (TEM) (C). We find that persistence length scales with the tube’s second moment of inertia, intrinsic twist tends not to be present except when forced by sequence design and thermal twist occurs on lengths much shorter than the persistence length. We show that these results can be understood in terms of a quantitative DNA nanotube elasticity model, which takes the deformations of the DNA duplexes, as well as the strand cross-overs between them into account. To gain a better understanding of the interplay between the molecular architecture of DNA nanotubes and their micrometer-scale persistence length we study the thermal bending fluctuations of several six-helix-tubes with variations in the density and placement of strand cross-over and backbone nicks. We find that staggering cross-overs in one cross- sectional plane as well as decreasing the overall density of cross-overs significantly decreases persistence length and discuss these results in terms of the previously derived elasticity model. We present several design strategies for DNA nanotubes with defined intrinsic torsion, intrinsic curvature and combination of both. Curvature and torsion were controlled by ei- ther targeted insertion and deletion of basepairs, specific programming of the folding pathway or specific placement of complementary sequence motifs within the DNA nanotube lattice. We characterize intrinsic tube deformations by TEM, atomic force microscopy (AFM), temperature controlled UV-absorbance and stochastic image reconstruction mi- croscopy (STORM) and show that intrinsically curved tubes predominantly form closed rings (D) and tubes with a combination of curvature and torsion have a helical contour. We show that the attachment of the organic dye Cy3 to one or several DNA oligonucleotides of HX-tubes can also cause tube deformations (E). We systematically study pitch and radius of the observed helical tube contour as function of Cy3 attachment position and propose a Cy3-DNA binding scheme that depends on the DNA microenvironment of the binding site. We further investigate the optical properties of Cy3 on HX-tubes by fluorescence polarization microscopy (FPM) and fluorescence lifetime measurements. We derive a relation between anisotropy and alignment of Cy3 dipoles. Our model suggests an angle of approximately 60° between Cy3 dipole and DNA axis. We demonstrate that the self-assembly of fluorescent few-atom silver clusters (Ag-DNA) can be directed to hairpins on the surface of DNA nanotubes as a means of fluorescent labeling (F). We find that Ag-DNA on DNA nanotubes produces bright fluorescence, easily detectable by fluorescence microscopy. However Ag-DNA synthesis also promotes aggre- gation of DNA nanotubes. We investigate two new methods for the construction of micrometer scale DNA assem- blies based on the DNA origami technique: 1) Crystallization of rectangular DNA origami blocks into 1D and 2D lattices (G) and 2) Growth of DNA tiles on a ribbon shaped DNA origami template with sticky ends. The yield of both methods is estimated by gel electrophoresis, TEM and AFM. Lastly, we describe a set of Matlab tools that were written and used for automated tube contour digitalization from image data, calculation of persistence length, analysis of FPM data and design of DNA sequences.