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Adam, Hannah (2013): Etablierung einer Multiplex Real-Time PCR zum Nachweis der Escherichia coli-Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157, Establishing a multiplex real-time PCR for the detection of the Escherichia coli serogroups O26, O103, O111, O145 and O157. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) gehören zu den wichtigen, lebensmittelassoziierten Erregern von Gastroenteritiden. Schwere Erkrankungsverläufe, wie die postinfektiöse Komplikation HUS sind bekannt und betreffen meist Kinder unter 5 Lebensjahren. Als Primärquelle gelten Wiederkäuer, in deren Gastrointestinaltrakt das natürliche Habitat von Shigatoxin-bildenden E. coli liegt. Über fäkale Kontamination von Lebensmitteln, Wasser oder auch direkten Kontakt können STEC oral vom Menschen aufgenommen werden, wobei nicht alle STEC gleich virulent sind. Manche, wie z. B. die der Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157 werden wesentlich häufiger bei erkrankten Menschen nachgewiesen als andere. Ziel dieser Studie war es zum einen fünf Singleplex Real-Time PCR-Systeme und ein Pentaplex Real-Time PCR-System zum Nachweis der oben genannten fünf E. coli-Serogruppen am LGL, Oberschleißheim, zu etablieren. Die in der Norm ISO/TS 13136:2012 als „hochpathogen“ eingestuften STEC-Stämme können somit anhand der dort beschriebenen Primer- und Sondensequenzen aus Probenisolaten detektiert werden. Für die Validierung wurden die Selektivität, Sensitivität, Präzision und Richtigkeit der PCR-Systeme bestimmt. Zum anderen wurden die Daten von 8272 humanen Proben (einschließlich der des EHEC O104:H4-Ausbruchs von 2011), 1521 Lebensmittelproben, 240 Tierkotproben, 69 Schlachtkörperproben und 29 Wasserproben aus den Jahren 2009 bis 2011 aus Bayern sowie die STEC-Serotypisierungsergebnisse von 09/2004 bis 12/2011 ausgewertet und beschrieben. Im Vergleich mit der gängigen Serotypisierung mittels Agglutination bietet das Real-Time PCR-Verfahren insbesondere bei großem Probenumfang einen enormen Zeitvorteil. Das Pentaplex PCR-System ermöglicht zudem eine zeitgleiche Analyse von Probenisolaten auf alle fünf Serogruppen. Alle E. coli-Stämme der Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157 wurden durch die PCR-Systeme korrekt nachgewiesen. Die O103-Sondensequenz wurde hierfür zuvor modifiziert. Die Spezifität der Nachweissysteme für O26, O103 und O145 lag in Bezug auf E. coli bei 100 %. Bei den Nachweissystemen für O111 und O157 zeigten auch Bakterienstämme anderer Gattungen ein positives Ergebnis in der PCR (Serratia entomophila / rfbEO157-positiv und Shigella sp. LGL 2869 / wbd1O111-positiv). Die Datenauswertung ergab unter anderem einen hohen Anteil stx-positiver Tierkot- und Schlachtkörperproben von Rindern. Die meisten stx-positiven Lebensmittel stammten von Wiederkäuern. Vereinzelt waren auch potenziell humanvirulente STEC nachzuweisen. Der Großteil der nicht-humanen Proben war weder eae- noch EhlyA-positiv, während nur ein Viertel der humanen Proben keines der beiden Gene aufwies. Bei humanen Proben dominiert die Gruppe der unter 1 bis 5-jährigen Erkrankten und Frauen sind häufiger betroffen als Männer. Die E. coli-Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157 gehören zu den häufigsten in Bayern und 2011 infizierten sich 47 Menschen in Bayern mit EHEC O104:H4.

Abstract

Enterohemorrhagic E. coli belong to the important, food-associated pathogens that cause gastrointestinal infections. Serious courses of disease such as the postinfectious complication HUS are well known and majorly affect children below the age of five. Ruminants are considered as primary source and their gastrointestinal tract is the natural habitat of Shigatoxin-producing E. coli. STEC can be ingested by humans through faecal contamination of food and water but also through direct contact, even though not all STEC show the same degree of virulence. Some of them, for instance those belonging to the serogroups O26, O103, O111, O145 and O157, are considerably more frequently detected in sick humans than others. On the one hand, the aim of this study at the LGL, Oberschleißheim, was to establish both, five Singleplex real-time PCR-systems and one Pentaplex real-time PCR-system in order to detect the five E. coli serogroups mentioned above. This enables to detect the strains of E. coli, which according to ISO/TS 13136:2012 are rated “highly pathogenic” to humans by means of primer and probe sequences described in this ISO technical specification. Selectivity, sensitivity, precision, and trueness of the real-time PCR-systems were determined for validation. On the other hand, data of 8.272 human samples (including those belonging to the outbreak of EHEC O104:H4 in 2011), 1.521 food samples, 240 samples of animal faeces, 69 samples of carcasses, and 29 samples of water (from 2009 until 2011) as well as the results of STEC-serotyping, conducted between 09/2004 and 12/2011, were evaluated and described. In comparison with common serotyping through agglutination, real-time PCR offers a decisive time advantage, especially in terms of handling larger amounts of samples. In addition, the Pentaplex PCR-system enables a simultaneous analysis of sample isolates on all five serogroups. All E. coli strains that belong to the serogroups O26, O103, O111, O145 and O157 were detected correctly through the PCR-systems. The probe sequence of O103 was previously modified for this purpose. The specificity of the O26, O103 and O145 detection systems was referring to E. coli equivalent to 100 percent. But the detection systems for O111 and O157 showed positive results in bacterial strains of different genera (Serratia entomophila / rfbEO157-positive and Shigella sp. LGL 2869 / wbd1O111-positive). Data evaluation showed a high share of stx-positive bovine faeces and carcasses samples. Most of stx-positive food is originated in ruminants. Occasionally STEC that are potentially human pathogenic were detected. The bulk of non-human samples were neither eae- nor EhlyA-positive, whereas only a quarter of the human samples showed none of these two genes. Among the human samples those patients less than one to five years of age prevailed, and women were more often affected than men. The E. coli serogroups O26, O103, O111, O145 and O157 belong to the most common in Bavaria and in 2011 47 people were infected with EHEC O104:H4.