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Klinger, Alexandra Birgit (2013): Zur Wirkung des Seeanemonen Toxins II (ATX-II) auf spannungsgesteuerte Natriumionenkanäle neuronaler Zellen und zu den dadurch erreichten Änderungen im Schmerzempfinden. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

ATX-II wurde ursprünglich aus dem Gift der Seeanemone Anemonia sulcata isoliert und ist als potenter Aktivator spannungsgesteuerter Natriumionenkanäle (Navs) bekannt, da es einen persistierenden Na+-Strom induziert. Vor Kurzem wurden bestimmte Nav Subtypen mit menschlichem Schmerz in Verbindung gebracht. Somit liegt es nahe, dass detaillierte Kenntnisse über die Regulierung von Navs für die Entwicklung neuer Pharmaka im Bereich der Schmerztherapie von Vorteil sind. Auch der durch einen alternativen Inaktivierungsmechanismus entstehende resurgent current spielt nach Erkenntnissen der jüngsten Zeit eine Rolle im Schmerzgeschehen. Er kann einen Angriffspunkt für neue Analgetika darstellen, so man seine Entstehung und mögliche Modifikationen entschlüsseln kann. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob ATX-II resurgent currents von Navs in großen und kleinen murinen DRGs verändern bzw. induzieren kann. Zudem sollte beleuchtet werden, ob und wenn ja, welche Wirkung das Toxin auf periphere A- und C Schmerzfasern hat. Die Auswirkungen von ATX-II auf Navs wurden in großen und kleinen DRGs der Maus sowie in Zelllinien mit whole-cell voltage-clamp Messungen untersucht. Gesunde humane Probanden bewerteten Empfindungsänderungen (Schmerz und Juckreiz) nach intrakutaner Injektion von ATX-II. Mit Hilfe des "Laser Doppler Imagers" wurde das mögliche Auftreten eines Axon Reflex Erythems untersucht. Die mittels des FACS Zellsortierers nach Zellgröße sortierten DRGs wurden mit RT-qPCR auf ihren Gehalt an Nav1.6, Nav1.7 und 4 mRNA untersucht. ATX-II verstärkte resurgent currents in großen DRGs, zeigte in kleinen jedoch keinen Effekt. Im heterologen Expressionssystem trat ein resurgent current erst auf, wenn 4 Peptid über die Intrazellulärflüssigkeit zur Verfügung stand. Korrelierend zu den Befunden auf Zellebene rief ATX-II bei intrakutaner Injektion im Menschen nur solange stechenden Schmerz und veränderte mechanische Empfindung hervor, wie die A-Fasern für die Schmerzleitung verfügbar waren. Nachdem ein Nervenkompressionsblock angelegt und die Leitung via A-Fasern blockiert war, waren die ATX-II vermittelten Effekte verschwunden. Zudem konnte kein Axon Reflex Erythem gefunden werden, das ein Zeichen für eine C-Schmerzfaser-Aktivierung wäre. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass geringe Konzentrationen von ATX-II eine selektive Wirkung auf große DRGs haben. Erst durch Hinzufügen von 4-Peptid ist es möglich mit dem Toxin resurgent current in kleinen DRGs sowie Zelllinien mit heterolog exprimierten Nav1.6 und Nav1.7 zu induzieren. Dies lässt darauf schließen, dass es kleinen DRGs an 4 in ausreichender Menge mangelt und deshalb kein resurgent current sichtbar ist. Ebenso übt ATX-II einen Effekt auf A Fasern aus, die mit großen DRGs verbunden sind, wohingegen C-Fasern weitgehend unbeeinflusst bleiben. Die intrakutane Injektion von ATX-II führt zu stechendem Schmerz und einer Juckreiz ähnlichen Empfindung, die sich durch A-Faser-Block verhindern lässt. Daraus kann man schließen, dass ATX-II in niedrigen Konzentrationen als spezifischer A-Faser Aktivator fungiert.

Abstract

ATX-II was originally isolated from the venom of the sea anemone Anemonia sulcata and is characterized as a potent voltage-gated sodium channel (Nav) activator, as it induces a persistent sodium current. Recently specific sodium channel subtypes have been linked to human pain. Thus, detailed knowledge of Nav modulation may prove advantageous for the development of new pain treatments. As recently published resurgent current, as a result of an alternative inactivation, also plays a role in pain perception. It could represent a target for new analgesics, if we are able to elicit its origin and possible modifications. The aim of this work was to examine whether ATX-II can induce or change resurgent currents of Navs of large and small murine, sensory dorsal root ganglia neurons (DRGs). It was also to be determined if the toxin has an effect on peripheral A- and C pain fibers. The effects of ATX-II on Navs have been studied in large and small DRGs of mice and in cell lines with whole-cell voltage-clamp measurements. Healthy subjects rated sensation changes (pain and itch) after intracutaneous injection of ATX-II. A Laser Doppler Imager was used for analysis of the occurrence of an axon reflex erythema. Using a FACS sorter DRGs were sorted according to their cell size and were examined by RT-qPCR for their content of 1.6, 1.7 and 4 mRNA. ATX-II increased resurgent currents in large DRGs, but failed to influence small DRGs. In heterologous expression systems, resurgent currents only occurred if the 4-peptide was available intracellularly. ATX-II accordingly produced sharp pain and altered mechanical sensitivity in intracutaneously injected humans only as long as A-fibers were available for the transmission of pain. After a nerve compression block was applied and the A-fibers were blocked, this effect disappeared. In addition, no axon reflex erythema was observed, which would have been a sign for C-fiber activation. The results of this work suggest that low concentrations of ATX-II have a selective effect on large DRGs. Only by adding 4-peptide to the intracellular solution, it is possible to induce resurgent current in small DRGs and cell lines heterologously expressing Nav1.6 and Nav1.7. This suggests that small DRGs lack sufficient amounts of 4 and therefore no resurgent current is detectable. Likewise, ATX-II exerts an effect in large DRG-related A-fibers, whereas C-fibers remain largely unaffected. The intradermal injection of ATX-II causes a sharp pain and itch-like sensation, which can be prevented by selective A-fiber block. This suggests that ATX-II at low concentrations acts as a specific A-fiber activator.