DNA origami as a tool for single-molecule fluorescence studies

Stein, Ingo (2012): DNA origami as a tool for single-molecule fluorescence studies. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

Single-molecule fluorescence studies have become a routine practice in laboratories worldwide. As an experimental tool, especially fluorescence resonance energy transfer (FRET) has helped to unravel conformational changes and interactions of biomolecules. With the DNA origami method a new technique to create nanoscale shapes with DNA as a building material was recently introduced. As shown in this work, DNA nanotechnology can be readily combined with single-molecule FRET experiments, opening up new scientific prospects. With the progress of single-molecule techniques, the limiting factor for many applications is the quality of individual dye molecules. For successful single-molecule experiments, an understanding of the photophysical properties of dyes is essential. The first part of this thesis is devoted to providing fundamental insights into characteristic properties of fluorescent molecules. The common feature of single-molecule blinking is studied for the homologous series of cyanine dyes. A model is presented that allows predicting the blinking behavior of fluorophores, based on parameters such as the redox potential and chromophore size. The predictions are experimentally verified by evaluating fluorescence time transients of immobilized dye molecules. To characterize the distance dependence of FRET, in the past several approaches have been made to build a molecular ruler, including double stranded DNA and the polypeptide polyproline as spacer molecules. It is demonstrated that the DNA origami technique allows creating tailored molecular spacers that are specifically engineered to meet experimental requirements. A rigid DNA origami block was designed that can be used as a reliable FRET ruler on the single-molecule level. This approach offers distinct advantages compared to previous systems that suffered from limited persistence lengths and sample heterogeneity. The final project in this thesis was guided by the vision to use a DNA origami structure as a breadboard for molecular photonic circuits. In the future, light-based circuitry could help tackling limitations of current electronics. Exploiting the remarkable addressability of DNA origami objects, four spectrally distinct fluorophores were incorporated into a rectangular DNA origami at specific positions to create a spectroscopic network. The unique feature of this arrangement is that the energy transfer path can be manipulated by a mediator dye that guides the light to two spectrally distinct outputs. To visualize this control over the energy transfer path and for sorting of the subpopulations, a new experimental four-color FRET technique is developed, based on alternating laser excitation.

Abstract

Untersuchungen auf Basis von Einzelmolekülfluoreszenz werden weltweit standardmäßig eingesetzt. Besonders Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) hat als experimentelles Werkzeug dazu beigetragen Konformationsänderungen und Interaktionen von Biomolekülen aufzudecken. Mit der DNA-Origami-Methode wurde vor Kurzem eine Technik vorgestellt, die es erlaubt auf der Nanoskala Objekte mit DNA als Baumaterial zu formen. Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, kann die DNA-Nanotechnologie auf einfache Weise mit Einzelmolekül-FRET-Messungen kombiniert werden, was neuartige wissenschaftliche Entwicklungsmöglichkeiten schafft. Unter Anbetracht der Fortschritte von Einzelmolekültechniken ist die Qualität der einzelnen Farbstoffmoleküle das Nadelöhr für viele Anwendungen. Gerade deshalb ist ein Verständnis der photophysikalischen Eigenschaften von Farbstoffen unabdingbar um erfolgreich Einzelmolekülexperimente durchführen zu können. Im ersten Teil dieser Dissertation geht es um grundlegende Erkenntnisse in Bezug auf charakteristische Eigenschaften von Fluoreszenzmolekülen. Das typische Phänomen des Blinkens einzelner Moleküle wird für die homologe Reihe der Cyanin-Farbstoffe untersucht. Es wird ein Modell erarbeitet, dass die Vorhersage von Blinkeigenschaften von Fluorophoren auf Basis von Parametern wie dem Redoxpotential und der Größe des Chromophors erlaubt. Die Vorhersagen werden experimentell überprüft durch die Auswertung des zeitlichen Verlaufs der Fluoreszenz einzelner immobilisierter Farbstoffmoleküle. Um die Abstandsabhängigkeit von FRET zu charakterisieren, wurden bisher verschiedene Ansätze für die Konstruktion eines molekularen Maßstabes durchgeführt, unter anderem basierend auf doppelsträngiger DNA oder dem Polypeptid Polyprolin als Abstandshalter. Es wird gezeigt, dass mit Hilfe der DNA-Origami-Technik maßgeschneiderte molekulare Abstandshalter hergestellt werden können, die spezifisch auf die experimentellen Anforderungen abgestimmt sind. Ein starrer DNA-Origami-Block wurde entworfen, der als verlässlicher FRET-Maßstab auf Einzelmolekülebene einsetzbar ist. Dieses Verfahren bietet eine Reihe von eindeutigen Vorteilen im Vergleich zu bisherigen Systemen, die mit begrenzten Persistenzlängen und Probenheterogenität zu kämpfen hatten. Das abschließende Projekt dieser Arbeit wurde von der Vorstellung geleitet, DNA-Origami-Strukturen als Steckbrett für molekulare photonische Schaltkreise einzusetzen. In Zukunft könnten lichtbasierte Schaltungen dabei helfen, die Einschränkungen der aktuellen Elektronik zu überwinden. Durch Verwendung der bemerkenswerten Adressierbarkeit von DNA-Origami-Objekten wurden vier spektral verschiedene Farbstoffmoleküle an genau definierten Positionen in ein DNA-Origami-Rechteck eingebaut, um ein spektroskopisches Netzwerk zu erzeugen. Die Besonderheit dieser Anordnung ist die Manipulierbarkeit des Energietransfer-Pfades, wobei ein Vermittler-Farbstoff das Licht zu zwei spektral verschiedenen Ausgängen leitet. Um diese Kontrolle über den Weg des Energietransfers sichtbar zu machen und um Subpopulationen zu sortieren, wurde eine neue experimentelle vierfarbige FRET-Technik entwickelt, die auf alternierender Laseranregung basiert.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: single-molecule, fluorescence spectroscopy, DNA origami, FRET, nanotechnology
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 5. Juni 2012
• 1. Bericht­erstatter:in: Tinnefeld, Philip