Schilling, Eleonore (2011): Inducible expression of RANKL in transgenic pigs under the control of the Tet-On system. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine |
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Abstract
Because of the tremendous need for transgenic large animal models for human diseases, the process of SCNT is a crucial step in transgenic pig production. In our study, we evaluated the particular steps during the production for their impact on the efficiency of cloning transgenic pigs. For this purpose, statistical analysis was performed for all SCNT data from the years 2006 until June 2010. The RANKL transgenic osteoporosis model was chosen for an example for the production steps needed to finally achieve a disease model, to elucidate pitfalls and chances of SCNT procedure. In total 151 in vivo SCNT experiments using different transgenic cell lines were carried out, resulting in 243 piglets and fetuses. Statistical analysis revealed that donor cells treated exclusively in our laboratory had a significant better birth rate than donor cell originated of other laboratories. Furthermore, there was a significant relation between number of transferred NT embryos and later pregnancy checks, birth rate and abortion rate. The more NT embryos were transferred, the more pregnancies finished to terms. It was also elucidated that in our studies a different in vitro culture time of 24 or 48 hours had no significant impact on the outcome like pregnancy or birth rate. Seasonal changes during the years had no significant influence on pregnancy rate, birth or abortion. But there was a strong tendency that autumn showed best performance of all seasons, and most pregnancies were lost after embryo transfers during the summer. All these findings will be integrated in future in vivo SCNT experiments and embryo transfers. For the production of a transgenic osteoporosis model 17 in vivo experiments took place so far, with an outcome of 4 fetuses and 25 piglets. For gaining a controllable expression of RANKL, it was necessary to establish double transgenic pigs to sidestep harmful effects of RANKL overexpression during the fetal development. First attempts to integrate both genes, tetracycline controlled transactivator (Tet-On) and RANKL, in a single step of cell transfection and SCNT, had no satisfying result. We obtained 4 fetuses and stillborn recloned piglets carrying both genes, but they showed only expression of Tet-On and it was impossible to induce RANKL overexpression. Therefore the strategy was changed in favor to two rounds of transfection and nuclear transfer. First Tet-On transgenic piglets were established and screened for integration and expression. Piglet 9894 showed the best expression and severed as donor for next cell transfection step. These Tet-On + TARE RANKL cells were in vitro tested for their inducibility. Thereafter SCNT and embryo transfer of the best candidate were performed and they resulted in 4 pregnancies which all finished to term. One double transgenic piglet could be raised and will be kept until adulthood to establish a line of Tet-On +TARE RANKL transgenic pigs. Importantly, this founder animal showed inducible RANKL overexpression. Other constructs might be based on the existing Tet-On cell line in the future, offering an inducible system for a broad variety of different transgenes. Thus a functional Tet-On system in the pig is reported for the first time.
Abstract
Da es einen enormen Bedarf an transgenen Großtieren als Modelltiere für humane Erkrankungen gibt, wie zum Beispiel für Osteoporose, wurde die Generierung von transgenen Schweinen mittels somatischen Kerntransfers genauer untersucht. Dabei war das Ziel herauszufinden, welchen Einfluss die einzelnen Arbeitsschritte auf die Produktionseffizienz haben. Aus diesem Grund wurde eine statistische Analyse aller in vivo Kerntransfers von Anfang 2006 bis zum Juni 2010 durchgeführt. An dem Beispiel eines RANKL transgenen Osteoporose-Models wurden alle nötigen Produktionsschritte dargestellt und die Schwierigkeiten und Vorteile des somatischen Kerntransfers beschrieben. Die insgesamt 151 in vivo Experimente, wobei unterschiedliche transgene Zelllinien genutzt wurden, resultierten in 243 Ferkeln und Feten. Statistische Analysen zeigten, dass Spenderzellen, die ausschließlich in unserem Labor behandelt wurden, nach Kerntransfer zu einer signifikant höheren Geburtsrate der trächtigen Empfänger führten als Spenderzellen aus anderen Laboren. Weiterhin ergab sich ein Zusammenhang zwischen der Anzahl übertragener Kerntransfer-Embryonen und der späteren Trächtigkeitsrate, Geburtsrate und der Abortrate. Je mehr Embryonen übertragen wurden, desto mehr Trächtigkeiten wurden erfolgreich beendet. Es wurde auch sichtbar, dass in unseren Versuchen eine unterschiedliche in vitro-Kulturdauer der Kerntransfer-Embryonen von 24 bzw. 48 Stunden keinen signifikanten Unterschied in der Trächtigkeits- oder Geburtsrate verursachte. Auch für die verschiedenen Jahreszeiten konnte kein signifikanter Einfluss auf Trächtigkeit oder Geburt nachgewiesen werden. Es zeigte sich aber die Tendenz, dass im Herbst die besten Bedingungen für einen positiven Verlauf der Trächtigkeit herrschen und nach Embryotransfers im Sommer die höchste Abortrate auftritt. All diese Untersuchungsergebnisse werden zukünftig in unseren Arbeitsalltag integriert und der Kerntransfer und Embryotransferablauf optimiert. Zur Erstellung eines transgenen Osteoporosemodells wurden 17 Embryotransfers durchgeführt, die in 4 gewonnenen Feten und 25 geborenen Ferkeln resultierten. Um eine regulierbare RANKL Expression zu erhalten war es notwendig, doppelt transgene Schweine zu erstellen, so dass negative Nebeneffekte der RANKL Überexpression während der Fetalentwicklung vermieden wurden. Die ersten Versuche, Tetrazyklin Transaktivator (Tet-On) und RANKL in einem einzigen Schritt der Zelltransfektion und des in vivo Kerntransfers zu integrieren, führte zu wenig befriedigenden Ergebnissen. Es wurden 4 doppelt transgene Feten und 2 totgeborene Ferkel gewonnen, doch es konnte nur die Expression von Tet-On nachgewiesen werden, da die RANKL Expression nicht induzierbar war. Deswegen wurde die Strategie zu Gunsten von zwei Einzelschritten der Zelltransfektion und in vivo Kerntransfers gewechselt. Zuerst wurden Tet-On transgene Ferkel erstellt und auf Integration und Expression hin untersucht. Das Ferkel 8994 zeigte die beste Expression und seine Zellen wurden für den nächsten Zelltransfektionsschritt verwendet. Die daraus resultierenden Tet-On + TARE RANKL-Zellen wurden in vitro auf ihre Induzierbarkeit getestet. Als Spenderzellen für weitere in vivo Kerntransfers diente der beste Kandidat aus diesen Tests. Alle 4 Embryotransfers resultierten in Trächtigkeiten, die alle auch ausgetragen wurden. Ein doppelt transgenes Ferkel konnte aufgezogen werden, das zum einen nach Erreichen der Geschlechtsreife als Gründer einer transgenen Schweinelinie dienen wird, und im in vivo-Test eine induzierbare Expression von RANKL zeigte. Die regulierbaren Tet-On Zelllinien können auch für weitere zukünftige Konstrukte Verwendung finden, was die Möglichkeit mannigfaltiger genetischer Manipulation durch ein induzierbares System eröffnet. Hiermit wird das erste Mal von einem funktionalen und kontrollierbaren Tet-On System im Schwein berichtet.
Item Type: | Theses (Dissertation, LMU Munich) |
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Keywords: | Osteoporosis, large animal model, pig, scnt |
Subjects: | 500 Natural sciences and mathematics 500 Natural sciences and mathematics > 590 Zoological sciences |
Faculties: | Faculty of Veterinary Medicine |
Language: | English |
Date of oral examination: | 12. February 2011 |
1. Referee: | Wolf, Eckhard |
MD5 Checksum of the PDF-file: | 7e3677d3236965365dc1f7ce6263a646 |
Signature of the printed copy: | 0001/UMC 19499 |
ID Code: | 12766 |
Deposited On: | 08. Jun 2011 13:28 |
Last Modified: | 24. Oct 2020 04:03 |