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Mutational analysis of PhiC31 integrase to improve gene therapeutic applications
Mutational analysis of PhiC31 integrase to improve gene therapeutic applications
Die Bakteriophagen Integrase PhiC31 stellt ein viel versprechendes Werkzeug zur Integration genetischen Materials im nicht viral-basierten Gentransfer dar. Die PhiC31 Integrase vermittelt die Rekombination von spezifische Erkennungssequenz attB enthaltenden Plasmiden mit natürlich vorkommenden attP Erkennungssequenzen innerhalb des Zielgenoms mit unterschiedlicher Integrationsfrequenz und -spezifität. Nebeneffekte der Integration in Form von insertioneller Mutagenese, wie z.B. große Deletionen und chromosomale Veränderungen im Genom der Zielzelle konnten beobachtet werden. Ziel dieser Dissertation war, die PhiC31 vermittelte Effizienz zu verbessern und die Spezifität zu adressieren. Als Ansatz wurde die Mutagenese der DNA-Bindungsdomäne der Integrase basierend auf Punktmutanten zur verbesserten Integrationseffizienz gewählt. Integrationsassays wurden in verschiedenen humanen Zelllinien durchgeführt. Etablierung von Doppelmutanten, sowie Dosisoptimierung des Integrase kodierenden Plasmids verbesserten die Integrationseffizienz mehr als dreifach, verglichen mit der Wildtypintegrase in den Zelllinien HeLa und HCT. Weitere Assays verglichen die Exzisionsaktivität der Integrasemutanten mit dem Wildtyp. Bei fünf Mutanten wurde eine etwa zweifach erhöhte Exzision gefunden. Die Beurteilung der Spezifität der Integrasemutanten erfolgte durch Substitution der Wildtyp-attP Sequenz mit drei Pseudo attP Erkennungssequenzen des Reporterplasmids, deren erhöhte Spezifität bereits dokumentiert war. Einzelne Mutanten zeigten eine zweifach erhöhte Exzisionsaktivität. Die Rekombinationsaktivität von Integrasemutanten wurde im Kontext chromosomaler DNA mittels einer stabil GFP-exprimierenden Reporterzelllinie, in der die eGFP Expression mittels Integrase-vermittelter „Raus-Rekombination“ eines polyA Stoppsignals angeschaltet wird, untersucht. Auf chromosomaler Ebene wurde keine verbesserte Ausschneidungsaktivität erreicht. Zur Evaluierung der in vivo Effizienz zweier ausgewählter PhiC31 Integrasemutanten, die in vitro erhöhte Integrationsaktivität aufwiesen, wurden zwei Plasmide am C57BL/6 Mausmodell getestet. Reportergen war ein für den humanen Koagulationsfaktor IX kodierendes Gen. In Abhängigkeit von der Integrationseffizienz der Mutanten und des Wildtyps, wurden im Zeitraum von einhundert Tagen ähnliche Expressionslevel gefunden. Die Mutanten zeigten keine Verbesserung der Langzeitexpression von humanem Faktor IX. Die hier durchgeführten Studien zur Mutationsanalyse der Phagenintegrase PhiC31 zeigten einen wirksamen Ansatz zur Verbesserung der PhiC31 Integrase-vermittelten Integrationseffizienz in vitro., The PhiC31 integrase system represents an attractive tool for somatic integration of extrinsic genes or specific excision in applications such as therapeutic gene transfer or genetic engineering and transgenesis. In its most prominent role, the integrase mediates integration of plasmids carrying a therapeutic gene of interest and a specific attB site into pseudo attP sites. As a non-viral integrating vector, the PhiC31 integrase suffers from insufficient gene transfer and low integration efficiency. Additionally, aberrant events such as chromosomal rearrangements and deletions are known to occur at a given frequency of about 15 % within the host genome. Therefore, the goal of this study was to first optimise the PhiC31 integrase-mediated integration efficiency and second to optimise the specificity by performing site-directed alanine scanning mutagenesis for the first time within the DNA binding domain. In the course of this work, 22 single amino acid mutations were generated, which were then evaluated in antibiotic-selective integration assays in different human cell lines, based on cotransfection of integrase encoding plasmid and substrate plasmid with attB and neomycin resistance marker. Initial screening revealed one mutant with 1.7-fold higher integration efficiency. Upon optimisation of the plasmid ratio and with the creation of double mutants, the integration efficiency of two double mutants could be enhanced above threefold in HeLa cells. A nearly twofold improvement of one particular mutant could be achieved in Huh7 and in HCT cells, indicating that integration efficiency is cell line dependent. Intramolecular plasmid-based excision assays were established leading to gene activation of the reporter. At native attB ×attP recombination sites, five mutants with about twofold enhanced integration efficiency compared to wt integrase were identified, whereas recombination activity in chromosomal context of a stably integrating GFP reporter cell line showed no improvement. Increasing integrase plasmid dose fivefold and replacing the native attP site within the substrate plasmid by three preferentially targeted pseudo attP sites found in mammalian genomes did not result in any improvement of the integrase-mediated excision activity of a polyA termination site beyond twofold. To evaluate integration efficacy of PhiC31 integrase in vivo in murine liver a human coagulation Factor IX (hFIX) encoding substrate plasmid and the respective integrase encoding plasmid were co-injected via high-pressure tail vein injection into C57BL/6 mice. Two integrase mutants, K457A and D470A, showed a similar hFIX expression profile compared to wt integrase as determined by serum hFIX levels.
PhiC31 Integrase, nicht-virale Gentherapie, genomische Integration, Rekombination, Mutationsanalyse
Liesner, Raphael
2010
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Liesner, Raphael (2010): Mutational analysis of PhiC31 integrase to improve gene therapeutic applications. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Die Bakteriophagen Integrase PhiC31 stellt ein viel versprechendes Werkzeug zur Integration genetischen Materials im nicht viral-basierten Gentransfer dar. Die PhiC31 Integrase vermittelt die Rekombination von spezifische Erkennungssequenz attB enthaltenden Plasmiden mit natürlich vorkommenden attP Erkennungssequenzen innerhalb des Zielgenoms mit unterschiedlicher Integrationsfrequenz und -spezifität. Nebeneffekte der Integration in Form von insertioneller Mutagenese, wie z.B. große Deletionen und chromosomale Veränderungen im Genom der Zielzelle konnten beobachtet werden. Ziel dieser Dissertation war, die PhiC31 vermittelte Effizienz zu verbessern und die Spezifität zu adressieren. Als Ansatz wurde die Mutagenese der DNA-Bindungsdomäne der Integrase basierend auf Punktmutanten zur verbesserten Integrationseffizienz gewählt. Integrationsassays wurden in verschiedenen humanen Zelllinien durchgeführt. Etablierung von Doppelmutanten, sowie Dosisoptimierung des Integrase kodierenden Plasmids verbesserten die Integrationseffizienz mehr als dreifach, verglichen mit der Wildtypintegrase in den Zelllinien HeLa und HCT. Weitere Assays verglichen die Exzisionsaktivität der Integrasemutanten mit dem Wildtyp. Bei fünf Mutanten wurde eine etwa zweifach erhöhte Exzision gefunden. Die Beurteilung der Spezifität der Integrasemutanten erfolgte durch Substitution der Wildtyp-attP Sequenz mit drei Pseudo attP Erkennungssequenzen des Reporterplasmids, deren erhöhte Spezifität bereits dokumentiert war. Einzelne Mutanten zeigten eine zweifach erhöhte Exzisionsaktivität. Die Rekombinationsaktivität von Integrasemutanten wurde im Kontext chromosomaler DNA mittels einer stabil GFP-exprimierenden Reporterzelllinie, in der die eGFP Expression mittels Integrase-vermittelter „Raus-Rekombination“ eines polyA Stoppsignals angeschaltet wird, untersucht. Auf chromosomaler Ebene wurde keine verbesserte Ausschneidungsaktivität erreicht. Zur Evaluierung der in vivo Effizienz zweier ausgewählter PhiC31 Integrasemutanten, die in vitro erhöhte Integrationsaktivität aufwiesen, wurden zwei Plasmide am C57BL/6 Mausmodell getestet. Reportergen war ein für den humanen Koagulationsfaktor IX kodierendes Gen. In Abhängigkeit von der Integrationseffizienz der Mutanten und des Wildtyps, wurden im Zeitraum von einhundert Tagen ähnliche Expressionslevel gefunden. Die Mutanten zeigten keine Verbesserung der Langzeitexpression von humanem Faktor IX. Die hier durchgeführten Studien zur Mutationsanalyse der Phagenintegrase PhiC31 zeigten einen wirksamen Ansatz zur Verbesserung der PhiC31 Integrase-vermittelten Integrationseffizienz in vitro.

Abstract

The PhiC31 integrase system represents an attractive tool for somatic integration of extrinsic genes or specific excision in applications such as therapeutic gene transfer or genetic engineering and transgenesis. In its most prominent role, the integrase mediates integration of plasmids carrying a therapeutic gene of interest and a specific attB site into pseudo attP sites. As a non-viral integrating vector, the PhiC31 integrase suffers from insufficient gene transfer and low integration efficiency. Additionally, aberrant events such as chromosomal rearrangements and deletions are known to occur at a given frequency of about 15 % within the host genome. Therefore, the goal of this study was to first optimise the PhiC31 integrase-mediated integration efficiency and second to optimise the specificity by performing site-directed alanine scanning mutagenesis for the first time within the DNA binding domain. In the course of this work, 22 single amino acid mutations were generated, which were then evaluated in antibiotic-selective integration assays in different human cell lines, based on cotransfection of integrase encoding plasmid and substrate plasmid with attB and neomycin resistance marker. Initial screening revealed one mutant with 1.7-fold higher integration efficiency. Upon optimisation of the plasmid ratio and with the creation of double mutants, the integration efficiency of two double mutants could be enhanced above threefold in HeLa cells. A nearly twofold improvement of one particular mutant could be achieved in Huh7 and in HCT cells, indicating that integration efficiency is cell line dependent. Intramolecular plasmid-based excision assays were established leading to gene activation of the reporter. At native attB ×attP recombination sites, five mutants with about twofold enhanced integration efficiency compared to wt integrase were identified, whereas recombination activity in chromosomal context of a stably integrating GFP reporter cell line showed no improvement. Increasing integrase plasmid dose fivefold and replacing the native attP site within the substrate plasmid by three preferentially targeted pseudo attP sites found in mammalian genomes did not result in any improvement of the integrase-mediated excision activity of a polyA termination site beyond twofold. To evaluate integration efficacy of PhiC31 integrase in vivo in murine liver a human coagulation Factor IX (hFIX) encoding substrate plasmid and the respective integrase encoding plasmid were co-injected via high-pressure tail vein injection into C57BL/6 mice. Two integrase mutants, K457A and D470A, showed a similar hFIX expression profile compared to wt integrase as determined by serum hFIX levels.