Biochemische und funktionelle Untersuchungen der Transposase des Activator-Elements aus Zea mays

Adolphs, Ruth Hedwig (2001): Biochemische und funktionelle Untersuchungen der Transposase des Activator-Elements aus Zea mays. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Das Ac-Element aus Zea mays, das zur Familie der hAT-Elemente gehört, codiert für ein einzelnes Protein, die Transposase (TPase). Dieses Protein ist in vivo als einziges essentiell für die Transposition von Ac notwendig. Die Expression der TPase in E. coli war bisher nur in unlöslicher Form möglich. Der Nachweis, daß die TPase in vitro an die subterminalen Enden des Transposons bindet, wurde mit de- und wieder renaturiertem Protein erbracht (Kunze und Starlinger, 1989). In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal TPase in löslicher Form in E. coli exprimiert bzw. aus transgenen Tabakpflanzen isoliert. Die Reinigung des Proteins bis zur Homogenität war nicht möglich. Das lösliche Protein besitzt eine hohe Aggregationsneigung. In vitro wurde gezeigt, daß die TPase als Oligomer DNA bindet. Ein in vitro-Nachweis der endonukleolytischen Aktivität der TPase konnte jedoch nicht erbracht werden. Die Transposition von Ac läuft wahrscheinlich in einem synaptischen Komplex ab, in dem über zahlreiche Proteininteraktionen die Enden des Transposons in räumliche Nähe zueinander ge-bracht werden. Dabei ist die TPase als Oligomer aktiv (Kunze et al, 1993). Gleichzeitig unterliegt die TPase einer negativen Autoregulation. Bei hoher TPase-Konzentration in der Zelle oligomerisiert das Protein zu inaktiven Aggregaten. Die Transposition von Ac hängt vom Vorhandensein mehrerer Proteininteraktionsdomänen ab. In dieser Arbeit wurde eine C-terminale Dimerisierungsdomäne der TPase charakterisiert, die unter den Transposasen der hAT-Elemente hochkonserviert ist und sowohl an der Transposition als auch an der negativen Autoregulation von Ac beteiligt zu sein scheint. Damit ist es zum ersten Mal gelungen, einer der drei hAT-Domänen eine Funktion zuzuschreiben. Am N-Terminus der TPase wurde eine Oligomerisierungsdomäne identifiziert, die mehrere hydrophobe „Zippermotive“ enthält. In vitro ist diese zum Teil ebenfalls konservierte Domäne am Aufbau eines synaptischen Komplexes beteiligt. Als weitere Proteininteraktionsdomäne der TPase wurde die PQ-Domäne identifiziert, deren essentielle Funktion bisher unbekannt war. Diese Domäne ist in vitro am Aufbau des Transpososoms beteiligt, aber auch in die Ausbildung vermutlich inaktiver TPase-Aggregate verwickelt. Als mutmaßliches katalytisches Zentrum der Ac-TPase wurde durch Sequenzvergleiche mit bakteriellen Transposasen und in vivo-Transposition entsprechender Mutanten ein (N)DE-Motiv postuliert. Durch einfache Aminosäureaustausche wurden dabei zum ersten Mal hyperaktive TPase-Mutanten isoliert, die teilweise defekt in der Aggregatbildung sind. Der Aktivitätstest der TPase-Mutanten erfolgte unter anderem in einem neu entwickelten Transpositionssystem in Hefe (Weil und Kunze, 2000).

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 8. März 2001
• 1. Bericht­erstatter:in: Kunze, Reinhard