Untersuchen zur Regulation der uterinen und ovariellen Durchblutung sowie der Expression von Stickstoffmonoxidsynthasen und Östrogenrezeptoren im Verlauf des Zyklus und der Frühgravidität bei der Stute

Rohr, Simone (2003): Untersuchen zur Regulation der uterinen und ovariellen Durchblutung sowie der Expression von Stickstoffmonoxidsynthasen und Östrogenrezeptoren im Verlauf des Zyklus und der Frühgravidität bei der Stute. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

The aim of the present study was to estimate the influence of uterine NOS-system and the sexual steroids estrogen and progesterone on the blood supply of the uterus and the ovaries. Five trotter mares were examined in total during four estrous cycles and one early pregnancy. The investigations contained color Doppler- and ultrasound recordings as soon as the extraction of blood samples and endometrial biopsies. The first cycle was medically uninfluenced and investigations were carried out on Days 0 (= ovulation), 1, 5, 11, 15 and daily during estrous, whereas in estrous only one endometrial biopsy was taken. In the second cycle luteal regression was induced on Day 5 of diestrous with the PGF2α-analogon Tiaprost (Ilirenâ, 450 mg i.m.) and in estrous ovulation was induced with hCG (Choriolutinâ, 2500 IE i.v.), when the size of one follicle reached 35 mm. Investigations were carried out in this cycle immediately before giving PGF2α and 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 hours after that and then once a day up to ovulation. Endometrial biopsies were taken in each case before induction of luteolysis, 12 and 36 hours after that, before injection of hCG and immediately after ovulation. During the further two cycles the mares were treated orally with the NO donor ISDN (ISDN 40â, 30 mg, twice a day). Investigations were carried out on Days 0, 1 and 5 of the first cycle (ISDN I), as well as on Days 11, 15 and during estrous of the second cycle (ISDN II). During early pregnancy color Doppler recordings and blood samples were taken on Days 0, 1, 5, 11 and 15 of pregnancy, while endometrial biopsies were only gained on day 15. The analysis of uterine blood flow was based on the time-averaged maximum velocity (TAMV). Estrogens and progesterone were measured by an enzyme immunoassay. Nitrate concentrations were evaluated using Griess reacting. Total RNA was isolated from endo-metrial biopsies. Transcriptes encoding the estrogen receptors a and b and the endothelial as well as the inducible nitric oxide-synthase (eNOS and iNOS) were quantified by RT-PCR-analysis. The expression of eNOS-mRNA in control, as well as in the PGF2a-induced cycle, followed a consistent wavelike pattern (p < 0.05 and p < 0.0001). Both, eNOS and iNOS, showed their maximum of expression especially on Day 5 of diestrous and during estrous, when the highest levels of either progesterone or estrogen were measured. In the PGF2a-induced cycle, a significant connection between eNOS and progesterone was proved (p < 0.05). There was a positive correlation between the expression of the eNOS-mRNA and the uterine blood flow (p < 0.05) in the control cycle. In the PGF2a-induced cycle these two parameters also showed a similar cyclic pattern. The levels of estrogen-receptors in the endometrium or concentrations of estrogen in plasma were not related to the endometrial NO-synthases or to TAMV values. Plasma concentrations of nitrate were independent from the stage of estrous cycle and consequently were proved as unsuitable for the question raised here (in this case). The application of the NO donor ISDN leaded to a marked decrease of the uterine NOS-expression when compared with control cycle (p < 0.0001). An increase of uterine or ovarian perfusion during the application of ISDN was not provable (p > 0.05). In result of the biopsies on day 5 and of simultaneous ISDN application luteolysis was induced next to all mares. On day 15 of pregnancy, an increase in uterine and ovarian perfusion as well as an enhancement in iNOS-mRNA expression was observed. In conclusion, the results of this study indicate that the endometrial NO-synthases play an important role in the regulation of uterine blood supply during estrous cycle and pregnancy of the mare. Progesterone as well as estrogen seem to stimulate the endometrial expression of eNOS and iNOS, by which these hormones may indirectly influence uterine and ovarian blood flow.

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss des uterinen NOS-System und der Sexualsteroide Östrogen und Progesteron auf die uterine und ovarielle Durchblutung bei der Stute zu untersuchen. Fünf Traberstuten wurden jeweils über insgesamt 4 Zyklen und während einer Frühgravidität untersucht. Die Untersuchungen beinhalteten farbdoppler- und ultrasonogra-phische Aufzeichnungen, sowie die Gewinnung von Blutproben und Endometriumsbioptaten. Dabei verlief der erste Zyklus medikamentell unbeeinflusst mit Untersuchungen an den Tagen 0 (= Ovulation), 1, 5, 11, 15 und täglich während der Rosse, jedoch wurde in der Rosse nur an einem Tag ein Uterusbioptat entnommen. Im zweiten Zyklus wurde am Tag 5 des Diöstrus mit dem PGF2a-Analogon Tiaprost (Ilirenâ, 450 mg i.m.) die Luteolyse induziert und später in der Rosse, bei einer Follikelgröße von 35 mm, mit hCG (Choriolutinâ, 2500 IE i.v.) die Ovulation ausgelöst. Die Untersuchungen wurden in diesem Zyklus unmittelbar vor PGF2a, 30 min, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 Stunden danach und schließlich alle 24 Stunden bis zur Ovulation vorgenommen. Die Biopsieproben wurden jeweils vor Induktion der Luteolyse, 12 und 36 Stunden danach, unmittelbar vor der hCG-Injektion und nach Eintritt der Ovulation entnommen. Während weiterer zwei Zyklen wurde der NO-Donor ISDN (ISDN 40â, 30 mg, 2 mal täglich) oral verbreicht. Im ersten Zyklus (ISDN I) erfolgten die Untersuchungen an den Zyklustagen 0, 1 und 5, im zweiten Zyklus (ISDN II) an den Tagen 11, 15 und in der Rosse. Während der Frühgravidität wurden die farbdopplersonographischen Aufzeichnungen und die Blutproben-entnahmen an den Trächtigkeitstagen 0, 1, 5, 11 und 15 durchgeführt, eine Biopsieprobe wurde nur am Tag 15 gewonnen. Die Durchblutung in der A. uterina und der dominanten A. ovarica wurde anhand der mittleren Blutflussgeschwindigkeit (TAMV) semiquantitativ beurteilt. Die Östrogen- und Progesteronkonzentration im peripheren Blut wurden mittels EIA bestimmt, die Nitratspiegel wurden nach einem Verfahren auf Basis der GRIESS-Reaktion ermittelt. Die mRNA-Expression der endothelialen und der induzierbaren NO-Synthasen (eNOS und iNOS), sowie der Östrogenrezeptoren a und b (ERa und ERb) wurde mit Hilfe der RT-PCR-Analyse quantifiziert. Die mRNA-Expression der eNOS wies im Kontroll- wie im PGF2a-induzierten Zyklus ein zyklisches Muster auf (p < 0,05 bzw p < 0,0001), diejenige der iNOS nur im PGF2a-Versuch (p < 0,05). Die Expressionsmaxima der beiden NO-Synthasen traten vor allem am Tag 5 des Diöstrus und in der Rosse auf, also an den Tagen an denen entweder die höchsten Progesteron- oder die höchsten Östrogenkonzentrationen gemessen wurden. Im PGF2a-induzierten Zyklus wurde ein signifikanter Zusammenhang zwischen eNOS und Progesteron nachgewiesen (p < 0,05). Im Kontrollzyklus korrelierte die Expression der eNOS-mRNA signifikant mit dem uterinen Blutfluss (p < 0,05). Diese beiden Parameter zeigten auch im PGF2a-induzierten Zyklus einen gleichartigenVerlauf. Zwischen den Östrogenrezeptoren im Endometrium bzw. den Östrogenkonzentrationen im Plasma und dem NOS-System oder der genitalen Perfusion konnte kein Zusammenhang nach-gewiesen werden. Die Nitratkonzentrationen im Plasma folgten keinem zyklischen Muster und erwiesen sich somit für die hier aufgeworfene Fragestellung als ungeeignet. Die Applikation des NO-Donors ISDN führte zu einer, im Vergleich zum Kontrollzyklus verminderten Expression der uterinen NOS-mRNA (p < 0,0001). Eine Steigerung der uterinen oder ovariellen Durchblutung durch ISDN war nicht nachweisbar (p > 0,05). In Folge der Biopsieprobenentnahme am Tag 5 kam es bei gleichzeitiger ISDN-Applikation bei allen Stuten zur Luteolyse. Am Tag 15 der Gravidität wurde neben einer gesteigerten uterinen und ovariellen Perfusion auch eine deutlich erhöhte iNOS-mRNA-Expression beobachtet. Die vorliegenden Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das uterine NOS-System sowohl während des Zylus als auch während der Frühgravidität der Stute eine wichtige Rolle in der Regulation der genitalen Perfusion spielt. Progesteron wie auch Östrogen scheinen die endometriale Expression von eNOS und iNOS zu stimulieren, wodurch sie die Durchblutung indirekt beeinflussen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: NOSynthasen, Sexualsteroide, Stute, Durchblutung, inneres Genitale
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 7. Februar 2003