Untersuchungen zur Wirkung von östrogenwirksamen Stoffen auf die Gonadenentwicklung bei Fröschen (Rana temporaria und Xenopus laevis) sowie ultrastrukturelle und immunhistochemische Untersuchungen an Froschgonaden (Rana temporaria)

Steineck, Cornelia (2003): Untersuchungen zur Wirkung von östrogenwirksamen Stoffen auf die Gonadenentwicklung bei Fröschen (Rana temporaria und Xenopus laevis) sowie ultrastrukturelle und immunhistochemische Untersuchungen an Froschgonaden (Rana temporaria). Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

The influence of estrogen-like substances on the gonadal development in frogs (Rana temporaria and Xenopus laevis). Ultrastructural and immunohistochemical investiga-tions on the gonads of frogs (Rana temporaria). The aim of the present thesis was the investigation and assessment of the estrogen pollu-tion of a river in South-Germany above and below a sewage plant outlet and its possible effects on the gonadal development in amphibians. In an exposure experiment with differ-ent sewage dilutions the effect on the indigenous gras frog (Rana temporaria) were com-pared with the effects on the African claw frog (Xenopus laevis). Because of the lack of relevant data in current literature it was necessary to first collect some basic data on light microscopy, ultrastructure and immunohistochemistry with reference to frogs. Furthermore the sexual differentiation of two populations of different origin were compared histologically. Characterisation of the gonads The ovaries of Xenopus laevis displayed a garland-like structure in contrast to the compact ovaries of Rana temporaria. The ovaries of both frog species were surrounded by an epi-thelium and filled with germ cells which enclosed an ovarian cavity. The oogonies were mainly found in the peripheral parts of the organ. The oocytes were characterised by a big and irregularly shaped cell nucleolus with peripherally located nucleoli. They were sur-rounded by a thin one-layered follicular epithelium. Electron microscopical examination of the ovaries of Rana temporaria showed elongated tubular mitochondria in the cytoplasm which were found exclusively in oocytes. Some of the mitochondria from subadult frogs contained yolk crystals. Additionally an accumulation of electron-tight Granule was found just below the plasma membrane, which could be a preliminary stage of the cortical granule. The testis of the frogs were enveloped by an epithelium and a tunica albuginea which al-ready showed a tubular structure. The testis from Rana temporaria and the Xenopus laevis differed in their developmental stages. The testis of juvenile Rana temporaria contained only germ cells whereas the testis of some Xenopus laevis already contained spermato-cytes and spermatozoa. The spermatocysts, characteristic of frog testis, could be seen in conjunction with the appearance of spermatocytes only. By using light microscopy two different types of germ cells in both frog species could be distinguished which probably were primary and secondary germ cells. By electron microscopical investigation of the testis of Rana temporaria the somatic cells could, on the basis of location and morphology, be differentiated in two types. The somatic cells of the first type were located inside the Tubuli seminiferi and have probably the same function as the Sertoli cells of mammals. The cells of the second type, the Leydig cells or interstitial cells, were located outside the Tubuli and were characterized by granular vesicle in the cytoplasm. With view to the sexual differentiation of Rana temporaria a comparative histological inves-tigation of the gonads of juvenile and subadult frogs of a native midland population and a high alpine population was performed. The midland population proved to be a sexually semi-differentiated species since apart from clearly male or female animals it also com-prises intersex individuals in different stages of the transformation process. The genotypi-cally male animals developed female gonads in the first place which secondly converted into testis during a hermaphrodite stage. The transformation process from female into male gonads was, on the basis of morphological criteria, classified into three stages. The highal-pin population on the other hand proved to be a sexually differentiated race. By using the Avidin-Biotin-Complex-Technique five different antibodies were tested on the gonadal tissue of juvenile and subadult Rana temporaria. The test for Laminin, a non-collagen glycoprotein, which is part of the basal membrane in mammals, resulted in a posi-tive reaction. It seems therefore that similar to Laminin in mammals a glycoprotein plays an important part in the basal membrane of frogs. α-Actin, a fibrous protein of the smooth muscles, which was detected in the Theca externa of the layer of follicle cells in different species, could be established in the blood vessel wall only and not in the layer of follicle cells. Furthermore the occurrence of a Zona pellucida by using antibodies against the por-cine glycoprotein ZP3 was investigated. The ovum including the surrounding layer of follicle cells showed a negative reaction which however did not implicitly exclude the occurrence of a glycoprotein layer with a different antigenicity. Until now the existence of a glycoprotein layer in anurans, in connection with microscopical anatomy of ovaries in Rana temporaria or other species of frogs has not been mentioned in references. The examination of the go-nadal tissue as to the occurrence of ACE (Angiotensin Converting Enzymes) turned out negative as well. Example of application With the exception of a temporarily higher concentration of alkylphenol in the beginning of the exposure, the chemical analyses revealed a relatively low degree of pollution with alcyl-phenols and steroids. The results were comparable to other results of German rivers and stayed well below other European comparative data. According to the results of this study the current level of pollution of the experimental water with estrogens does not endanger the amphibian population. The examination did not reveal any influence of the sewage on the embryonal and larval development. Furthermore, the histological investigation of the gonads in exposed and unexposed frogs with reference to the gonadal sexual differentia-tion as well as the sex ratios did not reveal significant changes. There was no correlation as to the frequency of the occurrence of intersex in the groups of exposed and unexposed frogs, neither of Xenopus laevis nor of Rana temporaria. Only the transformation process from ovaries to testis of the sexually semi-differentiated species of Rana temporaria was slowed down in the group of exposed animals in contrast to unexposed animals. The rea-son for this phenomenon could be the inhibitive influence of the low-level but more continu-ous estrogen pollution in sewage than in river water. Conversely, a link between the accel-eration of the transformation process within the group of unexposed animals and the tem-porarily higher alkylphenol level in the beginning of the exposure cannot completely be ruled out. According to references alkylphenol can cause an increase of testosterone. The semiquantitative RT-PCR detecting Vitellogenin-mRNA carried out by the Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries in Berlin showed a minor increase in females of Xenopus laevis which were exposed to sewage in the ration of a 2:1 dilution in contrast to the unexposed animals. Taking into account the synergistic effects of estrogens, the in-crease could be attributed to the higher estrogen pollution of the sewage. The histopa-thological analysis for the detection of toxical effects of the sewage as well as other poten-tial influential factors provided no hints as to a possibly toxical influence of the sewage.

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung und Bewertung der Belastung eines süddeutschen Gewässer mit östrogenwirksamen Stoffen oberhalb und unterhalb eines Kläranlagenablaufs und deren mögliche Auswirkung auf die Gonadenentwicklung von Amphibien. In einem Expositionsversuch wurde die Wirkung unterschiedlicher Abwasserverdünnungen auf einheimische Grasfrösche (Rana temporaria) mit jenen auf den südafrikanischen Krallenfrosch (Xenopus laevis) verglichen. Zunächst wurden aufgrund der geringen Datenlage in der aktuellen Literatur Basisdaten zur Lichtmikroskopie, Ultrastruktur und Immunhistochemie bei Fröschen erhoben. Weiterhin wurde bei zwei Populationen unterschiedlicher Herkunft eine vergleichende histologische Betrachtung der Geschlechtsdifferenzierung vorgenommen. Charakterisierung der Gonaden Die Ovarien der Krallenfrösche wiesen eine girlandenartige Struktur auf, wohingegen die der Grasfrösche kompakt waren. Die Ovarien beider Froscharten waren von einem Epithel umgeben und mit Keimzellen ausgefüllt. Diese umschlossen eine zentral gelegene Ovarialhöhle. Die Oogonien fanden sich in den peripheren Bereichen des Organs. Die Oozyten waren durch einen großen, unregelmäßig geformten Kern mit peripher liegenden Nukleoli gekennzeichnet und wurden von einer einschichtigen, flachen Follikelzellschicht umgeben. Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung der Grasfroschovarien zeigten sich im Zytoplasma lang-gestreckte Mitochondrien vom tubulären Typ, welche ausschließlich bei weiblichen Keimzellen zu finden waren. Bei den Oozyten der subadulten Tiere enthielten einige der Mitochondrien Dotterkristalle. Weiterhin fiel bei den weiblichen Keimzellen eine Ansammlung elektronendichter Granula unterhalb der Plasmamembran auf, bei welchen es sich um eine Vorstufe der Kortikalgranula handeln könnte. Die Hoden der Frösche wurden von einem Epithel und einer Tunica albuginea umhüllt und ließen bereits eine tubuläre Struktur erkennen. Die Hoden der Gras- und Krallenfrösche unterschieden sich durch ihren Entwicklungsgrad. Während sich bei den juvenilen Grasfrö-schen ausschließlich Spermatogonien fanden, ließen einige der afrikanischen Krallenfrö-sche bereits Spermatozyten und Spermatozoen erkennen. Die für Froschhoden typischen Keimzysten konnten erst mit dem Auftreten von Spermatozyten beobachtet werden. Licht-mikroskopisch konnten bei beiden Froscharten zwei unterschiedliche Typen von Spermatogonien unterschieden werden, bei welchen es sich vermutlich um primäre und sekundäre Spermatogonien handelt. Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung von Grasfroschhoden konnten die somatischen Zellen, aufgrund ihrer Lage und Morphologie, deutlich in die innerhalb der Tubuli seminiferi gelegenen Zellen, welche vermutlich eine ähnliche Funktion übernehmen wie die Sertolizellen der Säugetiere und die außerhalb gelegenen Leydig’schen Zwischenzellen, deren auffälligsten Charakteristikum die Granular-vesikel im Zytoplasma waren, differenziert werden. Im Hinblick auf die Geschlechtsdifferenzierung von Rana temporaria erfolgte eine vergleichende histologische Untersuchung der Gonaden von juvenilen und subadulten Fröschen einer beheimateten Mittellandpopulation und einer hochalpinen Population. Die Mittellandpopulation erwies sich als geschlechtlich semidifferenzierte Rasse, die neben eindeutig männlich oder weiblich differenzierten Tieren auch intersexuelle Individuen in unterschiedlichen Stadien des Transformationsprozess erkennen ließ. Bei diesen Tieren entwickeln zunächst auch genotypisch männliche Individuen weibliche Gonaden, die sich dann über ein Hermaphroditenstadium in Hoden umwandeln. Der Transformationsprozess der weiblichen in männliche Gonaden wurde anhand von morphologischen Kriterien in drei Stadien eingeteilt. Bei der hochalpinen Population handelte es sich um eine geschlechtlich differenzierte Rasse. An Gonadengewebe von juvenilen und subadulten Grasfröschen wurden mittels der Avidin-Biotin-Komplextechnik fünf verschiedene Antikörper ausgetestet. Die Untersuchung auf Laminin, ein nicht kollagenes Glykoprotein, welches ein Bestandteil der Basalmembran bei Säugern ist, ergab eine positive Reaktion. Somit scheint auch in der Basallamina von Fröschen ein dem Laminin der Säugetiere strukturell ähnliches Glykoprotein eine wichtige Rolle zu spielen. α-Aktin, ein Faserprotein der glatten Muskulatur, welches bei verschiedenen Spezies in der Theka externa der Follikelzellschicht nachgewiesen wurde, konnte bei den untersuchten Froschgonaden ausschließlich in Gefäßwänden, also nicht in der Follikelzellschicht, nachgewiesen werden. Desweiteren wurde das Vorkommen einer Zona pellucida unter Anwendung von Antikörpern gegen das porcine Glykoprotein ZP3 untersucht. Die Eizelle inklusive der sie umgebenden Follikelzellschicht reagierten negativ, was jedoch das Vorhandensein einer Glykoproteinschicht anderer Antigenität nicht ausschließt. Eine Glykoproteinschicht bei Anuren wurde bisher jedoch von keinem Autor im Zusammenhang mit der mikroskopischen Anatomie der Ovarien von Rana temporaria oder anderen Froscharten erwähnt. Die Untersuchung des Gonadengewebes im Bezug auf das Vorkommen von ACE (Angiotensin-Converting-Enzyme) verlief ebenfalls negativ. Anwendungsbeispiel Mit Ausnahme der zu Beginn des Versuchs kurzzeitig aufgetreten höheren Alkylphenolbe-lastung des Würmwassers, ergaben die chemisch-analytischen Untersuchungen des Expo-sitionswassers insgesamt eine als gering anzusehende Belastung mit östrogen wirksamen Substanzen. Die gemessenen Konzentrationen waren mit anderen Daten aus deutschen Gewässern vergleichbar und lagen deutlich unterhalb europäischer Vergleichswerte. An-hand der Untersuchungsergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass die aktuelle Belastung des Versuchsgewässers keine Gefährdung für Amphibienpopulationen darstellt. Die Untersuchung ergab keinen Einfluss des Abwassers auf die Embryonal- und Larvalent-wicklung. Ebenso konnten bei der histologische Beurteilung des Gonadengewebes von exponierten und Kontrollfröschen hinsichtlich der gonadalen Geschlechtsdifferenzierung sowie der Geschlechterverhältnisse keine signifikante Veränderungen festgestellt werden. Die Häufigkeit des Auftretens von intersexuellen Individuen wies, sowohl im Falle der Kral-lenfrösche als auch bei Grasfröschen, keine signifikanten Unterschiede zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe auf. Lediglich der Transformationsprozess von Ovarien zu Hoden der im Versuch eingesetzten, geschlechtlich semidifferenzierten Grasfroschpopulation zeigte eine Verlangsamung bei den Abwasser-exponierten Tieren im Vergleich zur Würmwasser-Kontrollgruppe. Ursächlich könnte dies auf einen hemmenden Einfluss, der zwar nur in geringen Konzentrationen jedoch kontinuierlicher vorhandenen östrogenen Substanzen im Abwasser, zurückzuführen sein. Umgekehrt lässt sich auch eine Beschleunigung des Transformationsprozesses bei der Kontrollgruppe durch die zu Beginn des Versuchs kurz-fristig höher Nonylphenolbelastung nicht ganz ausschließen, da Nonylphenol, Literaturan-gaben zufolge, zu einer Erhöhung des Testosteronspiegels führen kann. Die vom Leibniz-Institut für Gewässerökologie und Binnenfischerei in Berlin durchgeführte semiquantitative RT-PCR zum Nachweis der Vitellogenin-mRNA ergab eine schwach signi-fikante Zunahme bei den weiblichen Tieren, die dem Abwasser in einer Verdünnung von 2:1 ausgesetzt waren, im Vergleich zu Kontrollgruppe. Unter Berücksichtigung synergisti-scher Effekte östrogener Substanzen, könnte der Anstieg auf die insgesamt etwas höhere Belastung des Abwassers zurückzuführen sein. Die durchgeführte histopathologische Un-tersuchung zur Erkennung toxischer Effekte von Abwasserinhaltsstoffen sowie anderer potentieller Einflussfaktoren lieferte keine Hinweise auf eine mögliche toxische Wirkung des Abwassers.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: östrogenwirksam, Gonadenentwicklung, Krallenfrosch, Kläranlage, Ovarien
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 7. Februar 2003