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Bück, Cornelius (2008): Sequenz und Struktur des Proenteropeptidase-Gens als Basis für Mutationsanalysen bei angeborenem Enteropeptidasemangel. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Es war im Jahr 1969, als erstmals der angeborenen Enteropeptidasemangel bei Neugeborenen und Säuglingen als neues und eigenständiges Krankheitsbild entdeckt wurde, dessen klinische Symptomatik hauptsächlich durch eine ausgeprägte Hypoproteinämie charakterisiert ist und dessen Verlauf unbehandelt tödlich enden kann. Schon damals wurde vermutet, dass dieses Krankheitsbild ursächlich durch einen genetischer Defekt bedingt sei. Bislang allerdings war noch nicht die Voraussetzung geschaffen, um diesbezüglich routinemäßig genetische Untersuchungen durchführen zu können. Denn die wesentliche Voraussetzung dafür, nämlich die Struktur des Krankheits-Gens (Abfolge von Exons und Introns des Proenteropeptidase-Gens), war bisher nicht bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die cDNA-Sequenz der Enteropeptidase mit sich überlappenden Oligonukleotid-Primerpaaren besetzt, die jeweiligen PCR-Produkte mit Didesoxyterminatoren sequenziert und mittels PC-Software Sequence-Navigator ausgewertet, so dass auf diese Weise die Struktur des Proenteropeptidase-Gens vollständig bestimment werden konnte. Zusätzlich gelang es den zum Proenteropeptidase-Gen gehörenden Promotorbereich (inklusive möglicher TATA-Box) durch nested PCR mit Hilfe eines speziellen Kits (Genome walk®) 1,26 bp weit zu entschlüsseln. Insgesamt besteht das Proenteropeptidase-Gen aus 24 Introns und 25 Exons, die zusammen mehr als 88 kb umfassen. Die Größen der einzelnen Exons liegen im Bereich zwischen 36 bp und 182 bp, die der Introns zwischen 158 bp und 9000 bp. Für eine spätere Mutationsanalyse wurden alle exonflankierenden Sequenzen durchschnittlich 200 bp weit dargestellt, so dass Intronprimer für die Amplifikation aller Exons abgeleitet werden konnten. In einem Testdurchgang ließ sich diese Methode anhand einer aus Leukozyten präparierten DNA etablieren. Als Fortsetzung dieser Arbeit war es nun meinen Kollegen möglich, Mutationen in Leukozyten-DNA zweier Patienten mit angeborenem Enteropeptidasemangel zu entdecken. Betroffen sind dabei jeweils beide Allele. In Zukunft können mit Hilfe der in dieser Arbeit vorgestellten Methode alle verdächtigen Patienten auf einen angeborenen Enteropeptidasemangel genetisch untersucht werden.