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Stumpf, Anita Natalie (2008): Molekular-epidemiologische Untersuchung klinischer Isolate des Enterobacter cloacae Komplexes und Identifizierung eines Genotyp-spezifischen Fitnessfaktors mit Krankenhaus-hygienischer Relevanz. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Vertreter des Enterobacter cloacae Komplexes sind gram-negative Bakterien der intestinalen Normalflora vieler Menschen und gleichzeitig häufige Erreger von Pneumonien, Septikämien und Harnwegsinfektionen auf Intensivstationen. Einen Unterschied zu anderen Krankheitserregern stellt die große Heterogenität des E. cloacae Komplexes dar. Er besteht aus 13 genetischen Clustern, von denen neun mittlerweile als Spezies bzw. Subspezies beschrieben sind. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, die Prävalenz der einzelnen Genotypen des Komplexes bei Patienten im Krankenhaus zu untersuchen und die Genotypen eventuell bestimmten Infektionsherden zuzuordnen. Deshalb wurden 196 prospektiv und randomisiert gesammelte klinische Isolate des E. cloacae Komplexes mittels hsp60 Sequenzierung ihren Genotypen zugeordnet und die Prävalenz sowie die Verteilung der Genotypen auf unterschiedliche klinische Materialien verglichen. Die wesentlichen Ergebnisse dabei waren, dass zwei Drittel der klinischen Isolate des E. cloacae Komplexes im Klinikum Großhadern den Subspezies von E. hormaechei und dem Cluster III zugeordnet werden konnten. E. cloacae Stämme, die dem Typstamm zugeordnet werden konnten, kamen selten vor und spielten offensichtlich eine sehr untergeordnete Rolle. Einige der Genotypen zeigten Präferenzen zu bestimmten klinischen Materialien, z.B. waren die Subspezies von E. hormaechei bei Wundinfektionen signifikant überrepräsentiert. Ein Großteil der Berichte über Infektionen mit Stämmen des E. cloacae Komplexes sind Berichte über klonale Ausbrüche. Zur Identifikation von klonalen Ausbrüchen sind schnelle und zuverlässige Methoden unverzichtbar. Die Validierung der dafür zur Verfügung stehenden PCR-basierten Methoden war für den E. cloacae Komplex aufgrund seiner Heterogenität bislang noch völlig unzureichend. Ebenso wenig war bekannt, wie oft klonale Ausbrüche tatsächlich in einem durchschnittlichen Krankenhaus vorkommen. Deshalb wurden in dieser Arbeit zwei PCR-basierte Methoden des genetischen „finger printings“ bei Bakterien, die ERIC- und REP-PCR, anhand zweier Genotypen des E. cloacae Komplexes auf ihr Potential hin untersucht, Isolate genetisch zu trennen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Häufigkeit klonaler Ausbrüche im Klinikum Großhadern in einem Zeitraum von fünf Jahren ermittelt. Dabei zeigte sich, dass die ERIC-PCR zur Differenzierung auf Stammebene im E. cloacae Komplex nicht geeignet ist, sie unterscheidet hingegen auf Genotypenebene. Mittels REP-PCR können klonale Isolate mit einer Spezifität von 90% identifiziert werden. Obwohl über fünf Jahre alle Blutkulturisolate untersucht wurden, wurden nur zwei klonale Übertragungen mit jeweils zwei betroffenen Patienten gefunden. Die Genotypen des E. cloacae Komplexes waren ungleich in der Klinik vertreten. Einige Genotypen hatten signifikante Assoziationen zu bestimmten klinischen Materialien. Außerdem schienen nicht klonale Ausbrüche, sondern viele Infektionen mit individuellen Keimen für die zunehmende Bedeutung der Vertreter des E. cloacae Komplexes als nosokomiale Erreger verantwortlich zu sein. Dieser Befund spricht für endogene Infektionen mit Stämmen des E. cloacae Komplexes. Mittels subtraktiver Hybridisierung wurde nach möglichen Faktoren gesucht, die eine verbesserte Überlebensfähigkeit im Krankenhausmilieu vermitteln könnten. Es wurde das Genom eines Sepsiserregers von dem eines Pflanzenisolates „genetisch subtrahiert“. Als Faktor, der möglicherweise die zunehmende Prävalenz von Infektionen mit Vertretern des E. cloacae Komplexes erklären könnte, fand sich eine Resistenz-Determinante gegen Silberionen. Da Silber als Desinfektionsmittel und Antiseptikum eingesetzt wird, würde eine Resistenz einen Überlebens- und Selektionsvorteil im Krankenhausmilieu darstellen. Eine genauere genetische Analyse der Silberresistenz-Determinante zeigte, dass die Nukleotidsequenzen sowie die abgeleiteten Proteinsequenzen im hohen Maße übereinstimmend waren mit denen der ursprünglich beschriebenen sil-Determinante auf Plasmid pMG101 von Salmonella enterica Serotyp Typhimurium. Der Aufbau der Determinante entsprach dem der Originalbeschreibung bei Salmonella enterica Serotyp Typhimurium. 63% der untersuchten Isolate des E. cloacae Komplexes besaßen diese Resistenz-Determinante. Die sil-Determinante war Genotypen-spezifisch verteilt, wobei die häufig in der Klinik vertretenen Genotypen signifikant öfter Träger der Silberresistenz waren. Die sil positiven Isolate wuchsen bei 8x höheren Konzentrationen Silbernitrat als die sil negativen Isolate. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die unterschiedliche Relevanz der Genotypen des E. cloacae Komplexes bei verschiedenen Infektionen gezeigt. Außerdem wurde durch Identifizierung genetischer Differenz zwischen einem pathogenen und einem als apathogen geltenden Isolats eine Teilerklärung für die unterschiedliche klinische Prävalenz gefunden. Aufbauend auf den vorliegenden Ergebnissen sollte die Virulenz-assoziierte Bedeutung der Silberresistenz-Determinante analysiert werden. Multizentrische Studien könnten die molekular-epidemiologische und Hygiene-Bedeutung des Fitnessfaktors beleuchten.