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Roßmann, Oliver (2008): Optimierung und Charakterisierung des lentiviralen Gentransfers in humanen mesenchymalen Stammzellen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Hintergrund Humane mesenchymale Stammzellen sind ein viel versprechendes Ziel für die ex vivo Gentherapie, und Lentiviren sind exzellente Vehikel für den Gentransfer in hMSCs, da sie hohe Transduktionsfrequenzen mit langfristiger Genexpression erreichen. Dennoch könnte die Seneszenz von hMSCs die therapeutische Anwendung, infolge von zeitaufwendiger Zellselektion und Virus Titration, limitieren. Diese Arbeit beschreibt optimierte Protokolle für hoch effizienten ex vivo lentiviralen Gentransfer in hMSCs und eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu bestimmen. Methoden EGFP wurde als Markergen/-protein verwendet, um verschiedene lentivirale Expressionsvektoren herzustellen. Die Produktion von Lentiviren wurde mit verschiedenen Verpackungssystemen getestet. Der Prozentsatz transduzierter Zellen wurde durch Polybrene und Blasticidinselektion erhöht. hMSCs von verschiedenen Spendern wurden mittels PCR und Western Blot analysiert. Regulierte Genexpression wurde durch Herstellung eines Tet-On selbstregulierten Expressionsvektors erreicht. Mit einem p24 ELISA-Test wurden übrig gebliebene virale Partikel im Zellkulturüberstand detektiert. Die Effizienz des lentiviralen Gentransfers wurde mittels Fluoreszenz-Mikroskopie beobachtet und mittels qRT-PCR und FACS-Analyse quantifiziert. Die lentiviralen Titer wurden mit qRT-PCR der exprimierten Transgene bestimmt. Die hMSC Differenzierung wurde histologisch untersucht. Ergebnisse Selbstinaktivierende lentivirale Vektoren der dritten Generation zeigten hoch effizienten Gentransfer in hMSCs bei der Verwendung von Polybrene. Die Blasticidinselektion hat den Prozentsatz der transgenen Zellen weiter erhöht unter Selektion von Zellen die mehrere Transgenkopien tragen. Die positiven Effekte von Polybrene und der Blasticidinselektion sind nicht von hMSCs eines speziellen Spenders abhängig. Präzise Regulation der Genexpression wurde durch Herstellung eines selbstregulierten Tet-On-Expressionssystems erreicht. Keine viralen Antigene wurden im Zellkulturüberstand nach aufeinander folgenden Medienwechseln detektiert, was auf die Abwesenheit von infektiösen Partikeln nach einigen Tagen hindeutet. In dieser Arbeit wurde ein starker linearer Zusammenhang zwischen der Virusverdünnung und der Stärke der Transgenexpression mittels qPCR Analysen beobachtet, wodurch die Virustitration durch Quantifizierung der Transgenexpression ermöglicht wird. Abschließend wurde durch Differenzierung in die adipogene, osteogene und chondrogene Richtung gezeigt, dass transduzierte hMSCs ihren Stammzellcharakter beibehalten haben und dass die Transgenexpression durch die Differenzierung nicht beeinflusst wurde. Schlussfolgerungen Die Quantifizierung der Transgen-Kopienanzahl durch qRT-PCR ist eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer nach dem ex vivo Gentransfer in hMSCs zu bestimmen. Die in dieser Arbeit optimierte und charakterisierte Methode für die effiziente lentivirale Transduktion von humanen mesenchymalen Stammzellen, in Verbindung mit regulierbarer Transgenexpression, ist ein sicheres, verlässliches und leistungsstarkes Verfahren und bildet eine aussichtsreiche Grundlage für zukünftige Gentherapie und Tissue Engineering Anwendungen in hMSCs.

Abstract

Background Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are a promising target for ex vivo gene therapy and lentiviruses are excellent gene transfer vehicles in hMSCs since they achieve high transduction rates with long-term gene expression. Nevertheless, senescence of hMSCs may limit therapeutic applications due to time-consuming cell selection and viral titration. This thesis describes optimized protocols for highly efficient ex vivo lentiviral gene transfer in hMSCs and a fast and reliable method to determine functional lentiviral titer by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Methods EGFP was used as a marker gene/protein to create different lentiviral expression vectors. Lentivirus production was tested with different types of packaging systems. The percentage of transduced cells was increased with polybrene and blasticidin selection. HMSCs from different donors were analyzed by PCR and western blotting. Regulated gene expression was achieved with the creation of a Tet-On self-regulating expression vector. Using p24 ELISA, remaining viral particles were detected in the cell culture supernatant. The lentiviral gene transfer efficiency was observed by fluorescence microscopy and quantified by qRT-PCR and FACS analysis. Lentiviral titers were determined by qRT-PCR of expressed transgenes. HMSC differentiation was assayed histological. Results Third-generation self-inactivating lentiviral vectors showed highly efficient gene transfer in hMSCs with the use of polybrene. Blasticidin selection further increases the percentage of transgenic cells with a selection of cells carrying multiple transgene copies. The positive effects of polybrene and blasticidin selection are not dependant on hMSCs from a specific donor. Tightly regulated gene expression was achieved by creating a self-regulated Tet-On expression system. No viral antigen was detected in the cell culture supernatant after serial media changes, suggesting the absence of infectious particles after a few days. In this thesis a strong linear correlation between virus dilution and level of transgene expression was observed by qPCR analysis, therefore allowing viral titering by quantification of transgene expression. Finally, it could be demonstrated that transduced hMSCs retained their stem cell character by differentiation towards adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineages and transgene expression was not affected by differentiation. Conclusions Quantification of transgene copy numbers by qPCR is a fast and reliable method to determine functional lentiviral titer after ex vivo gene transfer in hMSCs. The optimized and characterized method for lentiviral transduction of hMSCs, described in this thesis, together with regulated transgene expression, is a safe, reliable and powerful procedure and provides promising basis for future gene therapy and tissue engineering applications in hMSCs.