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Ludwig, Harald (2005): Untersuchungen zum Mutationsspektrum bei CADASIL. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Summary CADASIL (cerebral autosomal arteriopathy with subcortical infarcts and eukoencephalopathy) is a autosomal dominant disease,which lead among other things to migraen headache and early stroke. Shortly before beginning of this work Notch3 was identified as responsible gene. Notch3 coded for a large transmembranereceptor with 34 extracellularly located,epidermal growth factor (EGF) similar domains. In this work 70 related families (70 index patients and 13 relatives) with bioptisch secured diagnosis in substantial two Exons (3 and 4) were examined, since within this range the mutations accumulate. By sequencing of Exon 3 and Exon 4 mutations in 70 % of the cases were identified. Three types of mutations were found: Point mutations ((n = 50), Dinukleotid mutation (n = 1) and Deletionen (n= 2). In addition numerous Polymorphismen was identified (n =43). Seven of the mutated nucleotides mutations arose frequently, whereby transitions of cytosine to thymine occure. All mutations including the Deletionen led either to an acquisition or a loss of a Cystein. Therefore it is to be accepted obviously that the change of a Cystein in a EGF similar domain of Notch3 represents the crucial mutation mechanical which is responsible for CADASIL. With the Polymorphismen no changes of the Cystein arose. Genotyp/Phaenotyp correlations could not be proven. This stands in the agreement with the uniformity of the mutations. Due to the results of this work an improvement in the procedure results for the existing diagnostics. Scinbiopsie and MRT photographs can be supplemented by the sequencing of Exon 3 and 4. Thus 2/3 of the mutations are already discovered. If no mutations are found there, still the remaining 22 Exons of the extracellular domain can be sequenzed, whereby here first on Exon 6 (and 12) the emphasis should be put. This procedure is used meanwhile as standard technique for the diagnostics. In this work as the further supplementing diagnostic method the analysis with mutation-specific restriction enzymes was developed. Under consultation of the theoretically computed restriction enzymes of the 7 most frequent mutations one receives 52% (amount of = 37) of the mutations with 70 index patients (74% of the found mutations). In families, in which a mutation already admits is, further family members with this method let themselves be examined faster and more economically, than by sequencing. In this work it could be shown that forecasts of mutation effects make the development of protein models possible on the protein structure. As possible working hypothesis a Conformationchange ore a Surfacechange can be accepted, the one effect on the connection partner be had can and possibly the function affected. An incorrect dismantling of the Notch3 of receptor leads to the fact that truncated receptor fragments collect in the Media of the vessels in the proximity of osmiophilen deposits. Because of the stereotyped mutations with those frequently so-called CpG (modulators of the Epigenetic)is present further possible mutations can be predicted.

Abstract

Zusammenfassung CADASIL (cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy) ist eine autosomal dominant vererbte Erkrankung der kleinen Gefässe, die u.a. zu migräneartigen Kopfschmerzen und früh einsetzenden Schlaganfällen führt. Kurz vor Beginn dieser Arbeit wurde Notch3 als verantwortliches Gen identifiziert. Notch3 kodiert für einen grossen Transmembranrezeptor mit 34 extrazellulär lokalisierten, epidermal growth factor (EGF) ähnliche Domänen. In der vorliegenden Arbeit wurden bei 70 nicht verwandten Familien (70 Index-Patienten und 13 Familienangehörigen) mit bioptisch gesicherter Diagnose im wesentlichen zwei Exons (3 und 4) untersucht, da in diesem Bereich die Mutationen akkumulieren. Dabei wurden durch Sequenzierung von Exon 3 und Exon 4 in 70 % der Fälle krankheitsauslösende Mutationen identifiziert. Drei Typen von Mutationen wurden gefunden: Punktmutationen (Missense-Mutationen) (n= 50), Dinukleotid-Mutation (n= 1) und Deletionen (n= 2). Darüberhinaus wurden zahlreiche stille Polymorphismen identifiziert (n= 43). Bei sieben der mutierten Nukleotide traten Mutationen gehäuft auf, wobei es sich jeweils um Cytosin nach Thymin Transitionen handelte. Alle Mutationen inklusive der Deletionen führten entweder zu einem Erwerb oder Verlust eines Cystein-Restes. Deshalb ist es naheliegend anzunehmen, dass die Veränderung von einem Cystein in einer EGF-ähnlichen Domäne von Notch3 den entscheidenden Mutationsmechanis für CADASIL darstellt. Bei den Polymorphismen traten keine Änderungen der Cystein-Reste auf. Genotyp/Phänotyp Korrelationen liessen sich nicht nachweisen. Dies steht im Einklang mit der Einheitlichkeit der Mutationen. Auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit ergibt sich für die bestehende Diagnostik eine Verbesserung im Vorgehen. Hautbiopsie und MRT-Aufnahmen können durch die Sequenzierung von Exon 3 und 4 ergänzt werden. Damit werden bereits 2/3 der Mutationen entdeckt. Wenn dort keine Mutationen gefunden werden, können noch die restlichen 22 Exons der extrazellulären Domäne sequenziert werden, wobei hier zunächst auf Exon 6 (und 12) der Schwerpunkt gelegt werden sollte. Dieses Vorgehen wird mittlerweile als Standardverfahren für die Diagnostik eingesetzt. In dieser Arbeit wurde als weitere ergänzende diagnostische Methode die Analyse mit mutationsspezifischen Restriktionsenzymen entwickelt. Unter Hinzuziehung der theoretisch berechneten Restriktionsenzyme der 7 häufigsten Mutationen erhält man 52% (Anzahl =37) der Mutationen von 70 Indexpatienten ( 74% der gefundenen Mutationen). In Familien, in denen eine Mutation bereits bekannt ist, lassen sich weitere Familienmitglieder mit dieser Methode schneller und kostengünstiger untersuchen, als durch Sequenzierung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Entwicklung von Proteinmodellen Voraussagen von Mutationsauswirkungen auf die Proteinstruktur möglich machen. Als mögliche Arbeitshypothese kann eine Konformationsänderung oder eine Oberflächenveränderung angenommen werden, die eine Auswirkung auf den Bindungspartner haben kann und evtl. die Funktion beeinflusst. Ein fehlerhafter Abbau des Notch3 Rezeptors führt dazu , daß trunkierte Rezeptorfragmente sich in der Media der Gefässe in der Nähe von osmiophilen Ablagerungen ansammeln. Weiterhin lassen sich aufgrund der stereotypen Mutationen, bei denen die sogenannten CpG (Regulationseinheiten der Epigentic) betroffen sind, weitere mögliche Mutationsorte voraussagen.