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Kuznetsov, Alexander Vasilevich (2007): Molekularer Nachweis von Treponema pallidum mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Hybridisierung in verschidenen Proben von Patienten mit Syphilis. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Syphilis is one of the longest recognized sexually transmitted diseases of the world. After the discovery of Treponema pallidum (1905), the causative agent of syphilis, and the effective use of the antibiotic penicillin to treat the disease (1943), the diagnosis and elimination of syphilis appeared to be easy. The intervening years have shown that the syphilis remains a widespread infectious disease, which may occur in epidemics. Despite progress in the immunologic and serologic diagnosis, syphilis can still be difficult to diagnose of, especially in its latent stage. Routine diagnosis of syphilis may also in patients with co-infection by human immunodeficiency virus (HIV) or with concomitant autoimmune disorders. Because of its sensitive biological structure, T. pallidum cannot be cultured. Once the polymerase chain reaction (PCR) became available (1985), it became possible to identify T. pallidum with certainty on the basis of it specific DNA. Since 1990 PCR was used for diagnosis of syphilis in patients with genital ulcers, in congenital syphilis, and neurosyphilis. The PCR diagnosis of syphilis is not yet available for routine use. The goal in this work was to establish and evaluate PCR for the molecular diagnosis of syphilis on patient samples. The sensitive and specific nested PCR method was used for detection of the 47 kDa treponema pallidum protein (tpp47) gene. No gene polymorphisms were identified for tpp47 gene. After Southern blotting of the amplicon, an internal DNA probe should be used as an additional control. The tpp47 PCR was tested in various samples from patients. For the first time, PCR was used for samples of isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC), granulocytes, lymph nodes aspiration biopsy, and ejaculates. The PCR investigation of PBMC blood fraction had a highest sensitivity of 87.5 %, even in latent infection, if the PBMC was isolated by Ficoll following by high speed centrifugation. The previously published studies of PCR with serum and whole blood samples had a sensitivity of 61 – 66 %. The lymph nodes biopsy after Schaudinn and Hoffmann (1905) combined with PCR allowed the detection of T. pallidum DNA in patients without clinical symptoms of syphilis (latent stage). This approach is very important for the differential diagnosis of widespread lymphadenopathy which may also be caused by HIV infection. This work also showed for the first time by molecular biological methods that the ejaculate in syphilis is infectious, being positive for T. pallidum. In addition, this work showed that skin biopsy specimens from syphilitic lesions should not be embedded into paraffin before the DNA is extracted, but instead should be shock frozen for more sensitive detection of T. pallidum DNA. In addition, swab PCR was used to demonstrate that the pharyngeal mucosa in angina syphilitica of secondary syphilis does not contain T. pallidum. In patients without signs of syphilis and with unclear serological test results, sometimes because of HIV co-infection, latent syphilis was diagnosed by PCR analysis of PBMC, allowing institution of therapy rather than waiting for traditional tests to become positive again. This doctor thesis shows that syphilis diagnosis based on PCR is a sensitive and clinically important method, which can be especially important, if the syphilis serology is inconclusive.

Abstract

Syphilis ist eine der ältesten bekannten Geschlechtskrankheiten der Welt. Nach der Endeckung des Erregers, Treponema pallidum (1905), und dem Einsatz des Antibiotikums Penicillin in der Syphilis-Therapie (1943) schienen Diagnostik und Bekämpfung der Syphilis nur noch eine Routineaufgabe. Die vergangenen Jahrzehnte haben gezeigt, dass die Syphilis eine sich immer noch verbreitende, oft epidemisch verlaufende Infektionskrankheit ist. Ungeachtet der immunologischen und serologisch-diagnostischen Forschritte in der Syphilis-Diagnostik ist diese Infektionskrankheit besonders in ihrer latenten Form manchmal schwer zu diagnostizieren. Besonders im Falle einer Koinfektion mit human immunodeficiency virus (HIV) oder bei systemischen Autoimmunerkrankungen kann die etablierte Routinediagnostik der Syphilis fehlschlagen. Die traditionelle mikrobiologische kulturelle Diagnostik lässt den Erreger auf Grund seiner sehr empfindlichen Struktur nicht wachsen. Dank der Endeckung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, 1985) ist es möglich geworden, den Krankheitserreger anhand seiner spezifischen DNS-Struktur sicher zu identifizieren. Seit 1990 wurde die PCR für die Diagnostik der Syphilis bei Genital-Ulzera, bei angeborener Syphilis und Neurosyphilis eingesetzt. Für den klinischen Alltag war die PCR-Diagnostik der Syphilis bis jetzt nicht verfügbar. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Überprüfung der PCR für die Molekulardiagnostik der Syphilis unter Verwendung von Patientenproben. Ein sensitives und spezifisches nested (verschachteltes)-PCR-Verfahren wurde für den Nachweis des 47 kDa treponema pallidum protein (tpp47)-Gen eingesetzt. Für dieses Gen ist bis jetzt keine Polymorphismus bekannt. Spezifische DNS-Hybridisierung nach Southern-Blot des Amplikons mit einer internen DNS-Sonde sollte die PCR-Spezifität zusätzlich kontrollieren. Die tpp47-PCR wurde mit verschiedenen Patientenproben getestet, unter anderem zum ersten Mal mit aufgereinigten peripheren Blut-mononukleären Zellen (PBMC), Granulozyten, Lymphknoten-Punktat und Ejakulat. Es stellte sich heraus, dass die Untersuchung der PBMC-Fraktion, gewonnen durch Ficollierung und anschließend Hochgeschwindigkeitszentrifugation die höchste diagnostische PCR-Sensitivät von 85,7 % auch bei latenter Infektion aufweist, während andere Studien, basierend auf Serum- und Vollblut-PCR, nur eine Sensitivität von 61 - 66 % hatten. Die Lymphknoten-Punktion nach Schaudinn und Hoffmann (1905) in Kombination mit einer PCR erlaubte den Nachweis von T. pallidum-DNS auch bei Patienten ohne klinische Zeichen einer Syphilis (sog. latente Syphilis), was in der Differenzialdiagnostik bei einer Polylymphadenopatie im Rahmen der HIV-Infektion sehr wichtig ist. Zum ersten Mal wurde mittels molekularbiologischer Methoden festgestellt, dass Ejakulat bei Syphilis infektiös ist, da es Treponemen enthält. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Hautbiopsate syphilitischer Läsionen nach der Gewinnung nicht in Paraffin eingebettet, sondern schockgefrohren sein sollten, um dann die T. pallidum-DNS mit höherer Sensitivität nachweisen zu können. Es wurde auch gezeigt, dass bei Angina syphilitica, welche bei sekundärer Syphilis auftritt, keine Treponemen an der Oberfläche der Rachenschleimhaut nachweisbar sind. Bei Patienten ohne Symptome einer Syphilis und mit unklarem serologischem Befund, unter anderem wegen einer HIV-Koinfektion, wurde mittels PCR-Analyse der PBMC eine latente Syphilis diagnostiziert und so eine adäquate antisyphilitsche Therapie ermöglicht. In der hier vorgelegten Doktorarbeit wurde gezeigt, dass die PCR-Diagnostik ein sensitives und klinisch wichtiges Verfahren in der Diagnostik der Syphilisinfektion darstellt. Der PCR-Einsatz kann in der Syphilis-Diagnostik besonders dann wichtig sein, wenn die Syphilis-Serologie nicht aussagekräftig ist und serologisch keine Diagnosestellung möglich ist.