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Ebner, Veronika (2006): Proliferation und Apoptose im Hepatozellulären Karzinom,der hepatozellulären Dysplasie, dem Adenom und anderen pathologischen Veränderungen der menschlichen Leber: Eine vergleichende immunhistochemische Untersuchung. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt weltweit zu den häufigsten Karzinomen, in Europa macht es zwar nur 3% der Karzinome aus – jedoch mit steigender Inzidenzrate. Diese ist möglicherweise auf eine Infektionswelle mit Hepatitis B und C von 1950 bis 1980 zurückzuführen (29, 125). Daneben zählen chronischer Alkoholabusus, Aflatoxin B1-Exposition und Leberzirrhose per se zu den Hauptrisikofaktoren für die Entstehung des hepatozellulären Karzinoms. Die Kenntnisse der molekularen Mechanismen der Karzinogenese in der Leber, insbesondere der Dysregulation von Proliferation und Apoptose sind indessen noch sehr lückenhaft. Die vorgelegte Arbeit wurde mit dem Ziel durchgeführt, einen Beitrag zur Klärung der formalen und molekularen Pathogenese der Hepatokarzinogenese zu leisten. Es wurde das Proliferations- und Apoptoseverhalten im hepatozellulären Karzinom (HCC, n=52) über immunhistochemische Verfahren und TUNEL-Hybridisierung untersucht. Dabei wurde die Expression des Proliferationsmarkers Ki-67, der Zellzyklus- und Apoptosekontrollproteine Fas-Rezeptor (Fas), Fas-Ligand (FasL), bax, bcl-2, p53 und der Apoptosemarker M30 und TUNEL mit normalem Referenzgewebe (RG, n=61), dysplastischen Knoten (DN, n=9), einem hepatozellulären Adenom (HCA, n=1), makroregenerativen Knoten (MRN, n=5), fokaler nodulärer Hyperplasie (FNH, n=3), undifferenzierten Karzinomen (n=2), einem cholangiozellulären Areal eines Kollisionstumors (n=1) und Metastasen primärer Lebermalignome (n=3) verglichen. Fragen waren dabei, - ob bestimmte Expressionsmuster der untersuchten Zellzyklus- und Apoptose-regulatoren kennzeichnend für die Hepatokarzinogenese sein könnten, - ob sich Hinweise auf eine Adenom-Karzinom- oder Dysplasie-Karzinom-Sequenz ergeben, - ob interindividuelle Unterschiede zwischen HCC abhängig von Ätiologie, histologischem Differenzierungsgrad, Tumorgröße, pT-Stadium und Morphologie bestehen und sich daraus Rückschlüsse auf ein jeweils charakteristisches tumorbiologisches Verhalten ziehen lassen, - ob sich aus den Ergebnissen relevante Schlussfolgerungen für Diagnostik und Therapie des Hepatozellulären Karzinoms ableiten lassen. Damit wird mit dieser Arbeit erstmalig eine komplexe Beleuchtung des Proliferations- und Apoptoseverhaltens im hepatozellulären Karzinom und in anderen Veränderungen der menschlichen Leber vorgelegt, die so bisher nicht vorgenommen wurde. Folgende Ergebnisse waren in der Auswertung der immunhistochemischen Untersuchungen festzustellen: HCC zeigten eine signifikant gesteigerte Ki-67-Expression, TUNEL-Positivität, bax-Expression, sowie eine signifikant verminderte Fas- und FasL-Expression gegenüber normalem Referenzgewebe (RG) (p<0,001), daneben zeigten HCC eine relativ starke M30- und p53-Expression bei nur vereinzelter bcl-2-Expression. HCV-assoziierte HCC wiesen eine signifikant niedrigere Apoptoserate (M30) auf, HBV-assoziierte HCC zeigten tendenziell eine höhere p53-Expression als HCC anderer Ätiologie. Gering differenzierte HCC zeigten die höchste Ki-67-Expression (p<0,001) und niedrigste Fas-Expression (p<0,01). Hoch differenzierte HCC zeigten eine Tendenz zu seltenerer p53-Exposition als mäßig und gering differenzierte HCC. Größere Tumoren wiesen eine signifikant höhere Ki-67-, p53- (p<0,01) und bax- (p<0,05) Positivität, sowie eine niedrigere Fas-Expression (p<0,01) auf. Die Tumorgröße korrelierte direkt mit der M30-Expression (p<0,01). Mit ansteigendem pT-Stadium bis pT3 war eine Zunahme der M30-Expression (p<0,01) zu beobachten. Im Vergleich verschiedener morphologischer Erscheinungsformen des HCC zeigten basophil-pseudoglanduläre Areale eine signifikant gesteigerte Ki-67-Expression gegenüber eosinophil-trabekulären (p<0,05) und klarzellig-soliden (p<0,01) Arealen, klarzellig-solide Areale zeigten die niedrigste M30-Expression (p<0,05). Das fibrolamelläre Karzinom (FLC) zeigte ein gegenläufiges Expressionsmuster mit Fas-Verlust bei hoher FasL-Expression. Die untersuchten Metastasen wiesen im Vergleich zu ihren Primärneoplasien in der Tendenz eine gesteigerte Ki-67-Expression und einen vergleichbar hohen Fas-Verlust bei allerdings höherer FasL-Expression auf. Bei M. Wilson war die höchste p53-Expression und Apoptoserate (M30, TUNEL) in Referenzgewebe zu beobachten. Während makroregenerative Knoten (MRN) und fokale noduläre Hyperplasien (FNH) im Expressionsverhalten dem Referenzgewebe vergleichbar waren, zeigte das untersuchte hepatozelluläre Adenom (HCA) eine höhere Ki-67-Expression bei gleichzeitig niedrigerer Fas-Expression als angrenzendes Referenzgewebe. Dysplastische Knoten zeigten im Vergleich zu MRN einen signifikanten Fas-Verlust (p<0,05) und waren erst von gering differenzierten HCC, die die niedrigste Fas-Expression aufwiesen, zu unterscheiden (p<0,05). Die Ki-67-Expression korrelierte höchst signifikant mit einer Progression von MRN über dysplastische Knoten hin zu hoch, mäßig und gering differenzierten HCC. Eine p53- und bax-Expression war nur in Dysplasien mit höhergradiger Atypie (HG-DN) zu beobachten. Kurzgefasste Diskussion der Ergebnisse: In unseren Untersuchungen wiesen HCC gegenüber Referenzgewebe eindeutige Veränderungen auf, die auf eine molekulare Dysregulation schließen lassen und bei gleichzeitig erhöhter Proliferations- und Apoptoserate Indiz für einen erheblich gesteigerten Zellumsatz sind. Der bekannte Fas-Verlust in HCC impliziert einerseits ein Umgehen der FasL-vermittelten Apoptose, andererseits war trotz verminderter FasL-Expression gegenüber Referenzgewebe abschnittsweise in HCC eine höhere FasL-Expression zu beobachten. Dadurch könnte eine Apoptoseinduktion immunkompetenter Lymphozyten bzw. angrenzenden Lebergewebes erfolgen. Dieses gegenläufige Expressionsmuster scheint umso mehr Bedeutung zu besitzen, als es sich gerade in den untersuchten Metastasen und im zu frühzeitiger Metastasierung neigenden fibrolamellären Karzinom feststellen ließ und dem Fas/FasL-System damit über das Phänomen der „Immunevasion“ eine wesentliche Bedeutung in der Karzinogenese zuweist. Neben dem Fas-/FasL-System stehen Störungen des Tumorsuppressorgens p53 und seines Genprodukts in der Diskussion der Hepatokarzinongenese. In unseren Untersuchungen scheint die höchste nachgewiesene p53-Positivität in Referenzgewebe bei M. Wilson einem physiologischen, möglicherweise oxidativ induzierten wt-p53-Protein zu entsprechen. Dagegen dürfte die in HCC gehäuft zu beobachtende p53-Expression am ehesten Ausdruck der Akkumulation eines funktionslosen Proteins sein. HBV-assoziierte HCC wiesen zudem eine höhere p53-Positivität auf als HCC anderer Ätiologie, was nach bisherigem Erkenntnisstand als p53-Genmutation durch DNA-Integration oder p53-Interaktion mit dem HBx-Genprodukt interpretiert wird. Die p53-Mutation wird als spätes Ereignis einer „Multistepkarzinogenese“ diskutiert, wofür in unseren Untersuchungen einerseits ein höherer p53-Nachweis in größeren und mäßig bzw. gering differenzierten HCC spricht. Andererseits war aber p53 auch in Dysplasien höhergradiger Atypie nachweisbar, ein Hinweis auf einen möglichen zweiten Pathogeneseweg mit direktem Übergang von höhergradiger Dysplasie in ein gering differenziertes Karzinom ohne den Weg über zunächst höher differenzierte Karzinome. Nachdem in der vorgelegten Arbeit p53 nur auf Proteinebene untersucht wurde, sind keine Aussagen zum Vorkommen oder zur Häufigkeit von p53-Mutationen möglich. Zur Klärung dieser Frage ist eine Gensequenzierung erforderlich. In Dysplasien war neben der erhöhten p53-Akkumulation ein erheblicher Fas-Verlust zu verzeichnen. Unsere Ergebnisse stützen somit die in der Literatur favorisierte Hypothese der Dysplasie-Karzinom-Sequenz. Ob dagegen das Expressionsmuster des HCA mit erhöhter Ki-67-Expression und verminderter Fas-Expression als Hinweis auf eine mögliche Transformation im Sinne einer Adenom-Karzinom-Sequenz zu werten ist oder allgemeines Neoplasie-Merkmal darstellt, das sich auch im gutartigen Adenom manifestiert, ist anhand der vorliegenden Studie nicht abschließend zu klären. Im interindividuellen Vergleich der HCC wiesen gering differenzierte HCC die höchste Proliferationsrate und den größten Fas-Verlust auf. Das heißt, die immunhistochemischen Ergebnisse widerspiegeln den histologischen Differenzierungsgrad und lassen sich als Indiz für eine Korrelation zwischen Phänotyp und Veränderungen auf molekularer Ebene deuten. Mit zunehmender Tumorgröße war ein gesteigerter Zellumsatz zu beobachten. Die von uns erstmalig vorgenommene Unterscheidung morphologisch verschiedener Phänotypen des HCC mit partiell signifikanten Unterschiede im Proliferations- und Apoptoseverhalten gibt Hinweise darauf, dass zusätzlich zu den konventionell erfassten Differenzierungsgraden auch andere strukturelle und zytologische Eigenschaften für die Prognose von HCC von Bedeutung sein könnten. Insbesondere trifft dies für basophil-pseudoglanduläre Karzinome bei höherer Proliferationsrate zu. Ob ätiologische Faktoren für die Induktion bestimmter Phänotypen verantwortlich sind, konnte durch diese Untersuchung nicht geklärt werden. Eine erhöhte Apoptoserate trotz Fas-Verlust in HCC deutet darauf hin, dass zum einen neben dem Fas/FasL-System weitere Signaltransduktionswege (z.B. bax) in die Apoptoseinduktion involviert sind, und zum anderen die Induktion des programmierten Zelltods auch in fortgeschrittenen HCC zu beobachten ist. Daraus könnten sich nach weitergehender Aufklärung der molekularen Mechanismen therapeutische Ansätze ergeben. Unsere Ergebnisse könnten Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen der Hepatokarzinogenesemechanismen liefern und für eine daraus resultierende differenzielle molekularpathologische Diagnostik als Grundlage einer zielgerichteten molekular definierten Therapie.