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Müller-Hartmann, Fabian (2007): Die Endothelaktivierung nach Hypoxie und Reoxygenierung - Hemmstrategien in vitro. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Das Endothel dient im ruhenden Zustand dem Gefäß als Barriere, die jedoch durch lokale Schädigung wie Trauma, Entzündung oder Ischämie aufgelöst werden kann (Klinke, 1996; Ley, 1996). Dieses Phänomen wird auch im Zusammenhang mit der Reperfusion zuvor ischämischer Myokardareale als so genannter Reperfusionsschaden beobachtet (Jennings, 1985; Schurmann, 1997). Erst das aktivierte Endothel ermöglicht Prozesse wie das Rolling, Sticking und die Migration zuvor frei fließender PMN und Thrombozyten, die über eine Reihe von Adhäsionsmolekülen wie u.a. E-Selektin und ICAM-1 vermittelt werden (Adhäsionskaskade, Sluiter, 1993; Froese, 1994; Fuster, 1996). Vorausgehende Untersuchungen konnten zeigen, dass die Endothelaktivierung in zwei Phasen verläuft, einer akuten nach Sekunden bis Minuten (Typ I) und einer subakuten nach Stunden bis Tagen (Typ II, Pober, 1990; Ichikawa, 1997). Akute Mechanismen verwenden die Freisetzung bereits bestehender Mediatoren wie PAF, Leukotriene, H2O2 und posttranslationale Modifikationen, für die subakuten Effekte ist jedoch eine Neusynthese von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen erforderlich (Nawroth, 1993; Kukielka, 1994). Dabei spielen Transkriptionsfaktoren wie NFκB eine bedeutende Rolle (Chen, 1998; Karin, 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein Zellkulturmodell mit neonatalen Rattenendothelzellen und humanen Umbilkalvenenzellen bzw. einer humanen Endothelzelllinie etabliert, womit auch Mechanismen der Hypoxie und Reoxygenierung (Reperfusionssituation) simuliert werden konnten (vgl. Material und Methoden 3.1 und 3.2). Eigens hergestellte HVJ-Liposomen (Dzau, 1996; Morishita, 1997) zeigten im Vergleich zu kommerziellen Reagenzien (Effectene, Qiagen) keine befriedigende Transfektionseffizienz, weshalb das Modell mit letzteren umgesetzt wurde (vgl. Ergebnisse 4.1 und 4.2). Nach Transfektion von Reportergenkonstrukten für ICAM-1 wurde die Expression dieser Adhäsionsmoleküle nach unterschiedlicher Zellstimulation beobachtet und mittels einer Renilla- bzw. Firefly-Luciferasemarkierung luminometrisch gemessen (vgl. Material und Methoden 3.3 und 3.7). Auf die Stimulation mit TNFα, PMN, Thrombozyten und/oder Hypoxie bzw. Reoxygenierung reagierten diejenigen ICAM-1-Reportergenkonstrukte in signifikantem Ausmaß, die eine entsprechende Bindungsdomäne für den Transkriptionsfaktor NFκB enthielten. Dort kam es regelmäßig zu einer Hochregulation der ICAM-1-Expression als Parameter einer Mehrsynthese dieser Adhäsionsmoleküle (vgl. Ergebnisse 4.3). Mittels Myeloperoxidase-Messungen (leukozytenspezifisches Enzym) konnten insbesondere adhärente PMN für diese Prozesse verantwortlich gemacht werden (vgl. Ergebnisse Abb. 4.10). Zur Beeinflussung dieser subakuten Endothelaktivierung wurden so genannte NFκB-Decoy-Oligodinukleotide eingesetzt (vgl. Material und Methoden 3.6), die teilweise die DNA-Bindungssequenz des intrazellulären NFκB-Komplex besetzten. Dadurch kam es zwar noch zu einer Translokation des NFκB-Komplex in den Zellkern, die konsekutive ICAM-1-Transkription und Proteinsynthese wurde jedoch verhindert (Tomita, 2003; Morishita, 2004). Diese NFκB-Decoy-ODN bewirkten nach Transfektion in zuvor mit TNFα, PMN, Thrombozyten und/oder Hypoxie bzw. Reoxygenierung aktivierte Endothelzellen eine signifikante Reduktion der ICAM-1 Reportergenexpression. Noch deutlichere Effekte wurden durch eine Veresterung der NFκB-Decoy-ODN (Phosphothioat als Proteinaseinhibitor) oder eine entsprechend frühere Transfektion (bis 48h vor Zellstimulation) gemessen (vgl. Ergebnisse 4.4). Der akuten Interaktion zwischen Endothel und PMN bzw. Thrombozyten wird im klinischen Alltag u.a. mit GpIIb/IIIa-Rezeptorantagonisten (Tirofiban und Abciximab) begegnet (Nigam, 2002; Schwarz, 2002). In unserem in vitro-Zellkulturmodell bewirkten diese Substanzen nach Endothelstimulation eine (in unterschiedlichem Ausmaß) verringerte Adhäsion von PMN und Thrombozyten am Endothel (vgl. Ergebnisse 4.5). Zudem zeigten sie überraschender Weise auch einen inhibitorischen Effekt auf die ICAM-1-Reportergenexpression und damit auf die subakute Endothelaktivierung (vgl. Ergebnisse 4.6). Abciximab war dabei Tirofiban und einem CD18-Antikörper (IB4) signifikant überlegen (vgl. Ergebnisse Abb. 4.19). Diese Daten legten die Überlegung nahe, beiden Strategien (Adhäsionshemmer vs. NFκB-Decoy-ODN) bezüglich ihres ICAM-1-inhibitorischen Potentials am Endothel zu vergleichen: in unseren Untersuchungen war die Transfektion von NFκB-Decoy-ODN der Gabe von Adhäsionshemmern (Abciximab, Tirofiban oder CD18-Antikörper) überlegen (vgl. Ergebnisse Abb. 4.20). Die Kombination beider Strategien (Adhäsionshemmer und NFκB-Decoy-ODN) zeigte geringe, zusätzliche, ICAM-1-inhibitorische Effekte (vgl. Ergebnisse Abb. 4.21). Die Applikation von Oligodinukleotiden wird inzwischen als eine viel versprechende Therapie insbesondere ischämiebedingter, kardiovaskulärer Erkrankungen gesehen: nach Transfektion von NFκB-Decoy-ODN wurden bislang bereits positive Effekte auf die Myokardfunktion (Sakaguchi, 2001), koronare Restenoserate (Rutanen, 2002) und den Myokardinfarkt selbst (Morishita, 1997) gezeigt. Eine aktuelle Patientenanwendung nach koronarer Stentimplantation (Jun-Ichi, 2004) ergab bei zusätzlicher Transfektion von NFκB-Decoy-ODN gegenüber dem konventionell versorgten Myokardareal geringere Restenoseraten.