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Obermeier, Martin (2006): Optimierung und quantitative Auswertung eines hochsensitiven Reverse Transkriptase-Aktivitäts Assays. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Vereinfachung und Optimierung der bekannten hochsensitiven RT-Nachweisverfahren. Hochsensitive RT-Nachweisverfahren bestehen aus der Generierung von cDNA aus einem heteropolymeren Template mit anschließender Amplifikation der entstandenen cDNA mittels PCR. Bei den ersten in der Literatur beschriebenen Verfahren zum hochsensitiven RT-Aktivitätsnachweis mit PCR-Amplifikationsschritt (PERT, Pyra 1994; AmpRT, Heneine 1995) handelt es sich um qualitative Verfahren mit Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid Färbung der PCR-Produkte als Read-out. Von diesen beschriebenen Verfahren wurde die Auswahl des heteropolymeren RNA-Templates und der grundsätzliche Ablauf, sowie einige Überlegungen zur Optimierung übernommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue, optimierte Primersequenzen für den RT-Schritt sowie für den PCR-Amplifikationsschritt entworfen. Diese Primersequenzen ermöglichen die Untersuchung der RT-Aktivität im Verlauf des RNA-Templates sowie die Untersuchung des Einflusses von RT-Inhibitoren. Es wurden die üblichen Optimierungsschritte wie MgCl2-Titration, Titration der Primerkonzentration und Variation der Annealing-Temperatur durchgeführt. Um eine Kontamination im Sinne eines Carry-over von PCR-Produkten zu verhindern, wurde ein UNG/dUTP System integriert und in seiner Wirksamkeit überprüft. Zwei verschiedene quantitative Read-out Verfahren wurden verglichen: Die Bestimmung der Menge an entstandenem PCR-Produkt am Ende des PCR-Schrittes stellte sich als arbeitsaufwändig heraus und ermöglichte nur einen geringem linearen Messbereich. Die Real-Time-Quantifizierung zeigte dagegen einen weiten linearen Messbereich und benötigt nach dem PCR-Schritt keine zusätzlichen Arbeitsschritte. Es konnte somit die Überlegenheit des Nachweises mittels Real-Time-PCR im Vergleich zur Endpunkt-Bestimmung gezeigt werden. Zur Real-Time Quantifizierung wurde für die Fluoreszenz-Detektion statt einer Exonuklease-Sonde (TM-PERT, TaqMan-Verfahren, z.B. von Maudru 1998 beschrieben) ein Molecular Beacon verwendet. Auch hier wurden die üblichen Optimierungsverfahren (Sonden-Titration, Einsaatmenge cDNA) durchgeführt. Mit dem entwickelten Verfahren können so geringste Mengen von RT-Aktivität, entsprechend ca. 40 Viruspartikeln mit hoher Kontaminationssicherheit und hoher Spezifität nachgewiesen werden. Es konnte das Ansprechen auf nukleosidische RT-Inhibitoren gesteigert werden, mit der Möglichkeit phänotypische Resistenztests auch gegen AZT durchzuführen. Zahlreiche viel versprechende Anwendungsgebiete des RT-Aktivitäts Nachweises mit dem hier etablierten Test sind jedoch derzeit für die Routineanwendung nicht zugänglich, solange die Probleme durch unspezifische Inhibitoren, wie sie beispielsweise im Blutplasma vorkommen, nicht gelöst sind. Um dieses Nachweisverfahren für die virologische Diagnostik einzuführen, wird ein stabiles und einfaches Aufreinigungsverfahren für RT aus Blutplasma von Patienten benötigt.