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Sarafoff, Nikolaus (2006): Amplifikation von Prionen in vitro. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Die Arbeit „Amplifikation von Prionen in vitro“ beruhte auf der Amplifikationsmethode die erstmals 2001 vorgestellt wurde (Saborio et al., 2001). Bei der PMCA wird erstmals PK-resistentes PrPres in ausreichender Menge in vitro hergestellt, welches molekularbiologisch dem Erreger spongiformer Enzephalopathien gleicht. Die PMCA erlaubt somit eine in vitro Untersuchung des pathologischen Umfaltungsprozess von PrPC zu PrPSc für diagnostische und therapeutische Studien. In dieser Arbeit wurden ausgiebig die Einzelschritte der PMCA Methode, insbesondere die Quantifikation der Western Blot Bande und die Auswirkungen der Sonifikationsleistung und der Inkubationszeit auf die Amplifikationseffizienz untersucht. Je nach Stärke der Sonifizierung ändert sich die Effizienz der PMCA Reaktion (Kap.‎3.1.2) . Eine Amplifikation ohne Sonifikation ist möglich, scheint aber nicht autokatalytisch aktives PrPres zu erzeugen und erfüllt somit nicht die Prion Hypothese ‎3.1.3 und ‎4.1). Neues PrPres kann als seed für weitere Amplifikationen dienen (Kap. ‎3.1.6). Parallelansätze zeigten die Reproduzierbarkeit der PMCA, so dass vergleichende Studien mit unterschiedlichen Reaktionsansätzen einen Vergleich der Amplifikationseffizienz ermöglichen (Kap ‎3.1.5). Die Intensitätsmessung von Western Blot Banden repräsentiert die Proteinmenge in vitro (Kap. ‎2.2.6). Es konnte gezeigt werden, dass PrPC und PrPSc essentiell für die Durchführung der Reaktion sind. Somit konnte gezeigt werden, dass die PMCA im Einklang mit der Prionhypothese steht, die besagt, dass ein pathogener PrPSc-Seed die Umfaltung von nativem PrPC initiiert. (Kap ‎3.1.4 und ‎3.2). Die molekulare Spezifität der PMCA Reaktion wurde hervorgehoben durch die Erkenntnis, dass rPrP die Amplifikation in vitro hemmt (Kap. ‎3.2, Bieschke et al., 2004). Prion Proteine binden Kupfer in vivo (Brown et al., 1997a) und in geringerer Affinität auch Ni, Mn und Zn (Jackson et al., 2001). Die Rolle von Metallen bei der Konversion von PrPC zu PrPSc ist noch nicht endgültig geklärt. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass bei Zugabe von Mn, Ni und Zink in ca. 10fach physiologischen Konzentrationen von 50µM und unphysiologischen 500µM die PrPres Amplifikation gefördert wird, während Cu keinen Effekt zeigt (Kap. ‎3.3.1). Gleichzeitig verringern alle Metallionen die Stabilität von neu entstandenem PrPres gegenüber PK (Kap. ‎3.3.2). Man kann sich den destabilisierten Zustand als ein Metallgebundenes PrP-Zwischenprodukt in der Umfaltung von PrPC zu PrPSc vorstellen (Sarafoff et al., 2005). Die PMCA Reaktion wie von Saborio et al. beschrieben hat einige Nachteile. Man arbeitet mit infektiösem Material in einem offenen System und verursacht eine Kontaminaton der Sicherheitswerkbank. Es wurden zwei Systeme zur automatischen Amplifikation im geschlossenen System entwickelt. Der Wasserbadamplifikator sonifizierte zyklisch das temperierte Becken in dem die Proben in einem Schwimmer genau positioniert wurden (Kap. ‎3.4.1). Es zeigte sich eine maximale Amplifikation von 14fach in der Mitte des Bades wohingegen die Konversionseffizienz zum Rand des Beckens hin gleichmäßig absank (Kap ‎3.4.2). Aufgrund der inhomogenen Ergebnisse mit dem Wasserbad wurde mit einem Microplate Horn der Munich Prion Cycler entwickelt, wo der gesamte Boden des Beschallungsbeckens vom Abstrahlkopf der Ultraschallsonotrode besteht, so dass eine homogene Leistungsverteilung erwartet wurde. Die Proben befanden sich in einer mit Plastikfolie versiegelten Mikrotiterplatte, so dass Verluste und Kontaminationen ausgeschlossen werden konnten (Kap. ‎3.4.3). Es konnte eine gleichmäßigere Amplifikation von 3,0 ± 0,7 gezeigt werden, wobei kein Abfall der Faktoren am Rand der Platte festzustellen war (Kap. ‎3.4.4). Es konnte mit den beiden hier vorgestellten Systemen zum ersten Mal eine Amplifikation von PrPres mit indirekter Sonifikation von verschlossenen Proben und dem Einfluss der Ultraschallleistung auf die Amplifikation gezeigt werden (Sarafoff et al., 2005). Dies zeigte auch, dass die Metalloberfläche der Sonotrode bei der manuellen PMCA keine katalytische Funktion bei der Konversion des Kupferbindenden PrPC zu PrPres innehat. Der Munich Prion Cycler ermöglicht eine homogene Amplifikation von Parallelproben im Mikrotiterformat. Die Entwicklung der ELISA Technologie zur Quantifizierung von PrP in Homogenaten wird in Zukunft ein limitierender Schritt in der Automatisierung der PMCA Reaktion sein (Kap. ‎2.2.7 und ‎4.4).