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Conrad, Claudius (2004): Vergleichende funktionelle und molekulare Charakterisierung humaner Zelllinienmodelle aus dem Knochenmark und dem peripheren Blut bezüglich deren Stammzellpotenz und Plastizität. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen und molekularen Charakterisierung von humanen CD34- Zelllinien aus dem peripheren Blut (V54/1, V54/2) im Vergleich zu den aus dem Knochenmark etablierten Zelllinien (L87/4, L88/5). Die Klone V54/1 und V54/2 wurden aus dem peripheren Blut nach Stammzellmobilisierung und CD6 Depletion durch Zugabe eines Faktorengemisches aus IL-1b, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8 und IL-11 erzeugt. L87/4 und L88/5 hingegen sind adhärente und wachstumsarretierte Stromazellen, die die Erhaltung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen durch Mediatoren ermöglichen (Thalmeier et al. 2000). Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Stammzelleigenschaften bei den Zelllinien L87/4, L88/5, V54/1 und V54/2. Dazu soll die Färbung mit den Farbstoffen Rhodamin 123 (Rh123) und Hoechst 33342 zeigen, ob Subpopulationen innerhalb der Klone mit unterschiedlichen Färbeeigenschaften, bestehen. Die biologische Bedeutung der beiden Farbstoffe liegt darin, dass Sie dazu geeignet sind frühe Stammzellen zu identifizieren. Als Substrat der P-Glykoproteinpumpe, die u.a. auf frühen Vorläuferzellen mit stark erhöhter Repopulationskapazität gefunden wird, werden diese Farbstoffe aus der Zelle gepumpt. Der Farbstoff-Efflux kommt durch die mdr-Gen-kodierte (multi-drug-resistance) und Kalzium-abhängige P-Glykoproteinpumpe zustande. Das P-Glykoprotein hat neben der Bedeutung in der Stammzellbiologie in der angewandten Medizin eine wichtige Funktion in der Resistenzentwicklung von Tumoren. Des weiteren wurden bei den Zelllinien stammzellrelevante Oberflächenantigene (CD10, CD34, CD14, CD105, SH3 und CD117) untersucht, um Unterschiede zwischen L87/4, L88/5 und den Klonen V54/1, V54/2 zu erkennen. Versuche zur Induktion der Differenzierung sollten Hinweise auf die Plastizität der Zelllinien geben. Experimente an den durch den Rh123-Efflux unterscheidbaren Subpopulationen der Zelllinie V54/2 dienen der Aufklärung von Unterschieden in Morphe, zellulären Transportfunktionen und Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken. Methodisch wurde für die Analyse der Epitope und der Färbungen mit Rh123 und Hoechst 33342 ein Durchflußzytometer verwendet. Die Analyse der Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken wurde mittels Reverse Transkriptase Polymerase Ketten Reaktion durchgeführt. Die Ergebnisse der Färbeexperimente zeigten, dass bei allen untersuchten Zelllinien durch eine unterschiedliche Anfärbbarkeit der Zellen mit dem Farbstoff Rh123 zwei Subpopulationen unterschieden werden können. Die jeweils größere Subpopulation der Zelllinien färbt sich mit Rh123 an und bleibt auch nach einer definierten Inkubationszeit, die den Rh123-Efflux ermöglichen soll, gefärbt. Sie wird Rh123high genannt. Die übrigen Zellen, die bei allen Zelllinien unter 10% der Gesamtpopulation betragen, sind in der Lage den Farbstoff aus der Zelle zu pumpen. Diese Subpopulation wird Rh123low genannt und ist mit Stammzelleigenschaften wie tausendfach erhöhter Repopulationsfähigkeit in NOD/SCID-Mäusen assoziiert. Es konnte also innerhalb der untersuchten monoklonalen Linien eine Rh123low Subpopulation identifiziert werden, die sich durch zahlreiche biologische Eigenschaften von der Gesamtpopulation unterscheidet. Da der Rh123 Efflux durch eine Kalzium-abhängige Pumpe zustande kommt, lässt sie sich durch den Kalziumantagonisten Verapamil hemmen. Eine Hemmung der Pumpe bewirkt, dass die Rh123low Zellen nicht mehr in der Lage sind Rh123 aus der Zelle zu pumpen, so dass sie nach einer definierten Inkubationszeit mit Rh123 gefärbt bleiben. Neben diesem funktionellen Beweis für die P-Glykoproteinpumpe konnte durch den strukturellen Nachweis der Pumpe mittels eines Antikörpers gegen P-Glykoprotein ein definitiver Beweis für das Vorhandensein der aktiven P-Glykoproteinpumpe bei der Rh123low Population erbracht werden. Mit dem anderen Farbstoff Hoechst 33342 können die jeweiligen Anteile der Zelllinien in den einzelnen Stadien des Zellzyklus nachgewiesen und zudem ein kleiner Anteil an Zellen bestimmt werden, der als „Side Population“ (SP-Zellen) definiert wird. Diesen SP-Zellen werden Eigenschaften von aktiven Stammzellen zugeschrieben. Hierbei besteht ein Unterschied zwischen den aus dem Knochenmark und den aus dem peripheren Blut etablierten Linien, da die Zellen aus dem peripheren Blut nicht nur ein anderes Zellzyklusmuster aufweisen, sondern auch einen höheren Anteil an SP-Zellen besitzen. Es wurden vergleichende Untersuchungen zwischen den Zelllinien und zwischen den Rh123high und Rh123low Subpopulationen innerhalb einer Zelllinie mit Antikörpern gegen die Epitope CD14, CD45, HLA-DR, CD10, CD117, CD105 und SH3 durchgeführt. Dabei waren CD14 und CD45 auf allen Zelllinien negativ, wobei alle Zelllinien eine positive Expression für den mesenchymalen Marker Endoglin (CD105) und für SH3 (CD73) zeigten. CD117 konnte nur auf den aus dem Knochenmark etablierten Zelllinien L87/4 und L88/5 nachgewiesen werden. CD34, ein charakteristischer Marker für hämatopoetische Vorläuferzellen, aber auch für Endothelzellen, konnte nur auf den Zellen der Rh123low Subpopulation nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu exprimieren die Rh123high Zellen kein CD34. Da es sich bei den Zelllinien um Klone handelt, ist der Unterschied in der Expression von CD34 zwischen der Rh123low und der Rh123high Population ein deutlicher Hinweis auf die Plastizität der Zelllinien und das Fließgleichgewicht zwischen Rh123low und Rh123high. Durch eine Zellsortierung der Zelllinie V54/2 wurde die Rh123low von der Rh123high Subpopulation getrennt, um sie dann bezüglich ihrer Morphologie, dem Wachstum in Methylzellulose und der Expression ausgewählter Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken zu untersuchen. Dabei erhärtete sich die Hypothese, dass es sich bei der Rh123low Subpopulation um aktivere Zellen mit einer gesteigerten Expression von erythroid/myeloischen und mesodermalen Eingaben (z.B. VEGF, BMP-4), Rezeptoren (z.B. tie-1), vernetzter Transkriptionsfaktoren (z.B. GATA, ETS) und letztendlich Ausgaben (z.B. PECAM) handelt. Diese fungieren in Netzwerken mit dem Ziel, stammzellrelevante Funktionen zu ermöglichen. Die Morphologie zeigte in den Zytozentrifugationspräparaten deutliche Unterschiede zwischen Zellen der Rh123low und der Rh123high Subpopulation. Die Rh123low Subpopulation besteht aus lymphoid-ähnlichen Zellen, was für Zellen mit Stammzellfunktion charakteristisch ist. Die Rh123high Subpopulation dagegen hat ein insgesamt größeres Zellvolumen und einen gebuchteten Kern mit perinukleärer Aufhellung. Untersuchungen des klonalen Wachstums in der Methylzellulose ergaben bei keiner der Subpopulationen eine wesentliche Koloniebildung. Durch die Inkubation der Zelllinie V54/2 mit dem Neurotropen Wachstumsfaktor (NGF) konnte eine morphologische Änderung in Richtung einer neuronalen/glialen Differenzierung nach 8-12 Stunden induziert werden. Der immunhistochemische Nachweis von Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) bestätigte die mesenchymale Potenz zumindest in Richtung einer glialen Differenzierung. Das unterschiedliche Expressionsmuster ausgewählter, für die Differenzierung notwendiger Zusammenspieler innerhalb von Transkriptionsfaktor Netzwerken innerhalb der Rh123high und der Rh123low Population bei V54/2 war ein weiterer Hinweis, dass es sich bei der Rh123low Subpopulation um aktive Vorläuferzellen mit möglicher Stammzellpotenz handelt. In der Rh123low Subpopulation wurde im Gegensatz zur Rh123high Population eine Expression von BMP4, GATA1, GATA3 nachgewiesen, die essentiell für die Hämatopoese und für eine mesenchymale Differenzierung ist. Die Faktoren für GATA2, GATA3, beta globin, Elf-1 und PECAM1 wurden in einem stärkeren Maß in der Rh123low als in der Rh123high Population exprimiert. BMP-Rez., Myb, sowie die Endothel-assoziierten Faktoren Tie-1 und VEGF waren in beiden Subpopulationen gleich stark vorhanden. Bei den wenigen Funktionseinheiten der größeren und Rh123high Population handelt es sich vor allem um angiogenetische Faktoren, was auf eine limitierte Differenzierungseigenschaft der Rh123high Subpopulation und die enge Beziehung zwischen Blut- und Endothelzellen („Hämangioblast“) hinweist. Ein Nachweis für die Plastizität der Stammzellen innerhalb der von uns etablierten Zelllinien wurde dadurch erbracht, dass die zellsortierten Subpopulationen Rh123low und Rh123high nach dem Sortierexperiment getrennt rekultiviert wurden, wobei das Wachstum der Rh123low Subpopulation deutlich langsamer war als das der Rh123high Subpopulation. Nach zwei Wochen wurden die zellsortierten Subpopulationen erneut einer Rh123 Färbung unterzogen, wobei sich wiederum das ursprüngliche Verhältnis zwischen den Rh123low und Rh123high Subpopulationen einstellte. So kann man aus der Transdifferenzierung der Zelllinien von Rh123low in Rh123high und umgekehrt die Plastizität der hier untersuchten adulten Stammzelllinien ableiten. Die Ergebnisse sollen zum grundlegenden Verständnis der Biologie adulter (nicht embryonaler) Stammzellen beitragen und damit die Möglichkeit schaffen, adulte Stammzellen bzw. deren Subpopulationen gezielt für einen reparativen Gewebe- und Organersatz zu verwenden. Dabei liefern sie die Basis für weitergehende Untersuchungen zum besseren Verständnis der physiologischen und regenerativen Vorgänge, z.B. auch bei Alterung oder bei gesteigerter Funktion. Darüber hinaus kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse durch weitere Untersuchungen möglicherweise besser verstanden werden, ob es gelingen kann das Potential adulter Stammzellen zur therapeutischen Gewebereparation, z.B. zur Verhinderung oder Verringerung einer Narbenbildung, zu nutzen.