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Gregor, Sebastian (2004): Untersuchungen zur Produktion und Chaperoninteraktion von Yersinia YopE und SycE mittels Reporterfusionstechnologie. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Yersinia enterocolitica produzieren Pathogenitätsfaktoren, die es ihnen ermöglichen, an die Zellen des Wirtes zu adhärieren, diese zu invadieren und protektive Immunantwort des Wirtes zu modifizieren. Dazu gehören die Yersinia outer proteins (YOP), die durch den Typ III Sekretionsweg über die Bakterienmembran in die Wirtszelle transloziert werden. Diese Sekretion wird durch das Chaperon SycE unterstützt. SycE bindet an YopE, verhindert die Degradation, stabilisiert die Faltung des Proteins und leitet es an die Sekretionspore. Mittels Reporterfusionstechnologie mit GFP und BFP sollte durch einen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), bei dem die Fluoreszenzenergie von BFP strahlenlos auf GFP übertragen wird wenn beide Proteine in einer Distanz von 1-10 nm liegen, die Interaktion der beiden Proteine intrazellulär dargestellt werden. Es wurden verschieden lange Yop-Fragmente mit dem Reprotergen gfp und SycE mit BFP fusioniert. Ferner sollte mit Hilfe der Reportergene gfp und luc die Produktion von YopE und SycE in vitro verfolgt werden. Zusammenfassend ist die Darstellung der Interaktion mittels FRET schwierig, da mikroskopisch eine erwartete Grünfluoreszenz gezeigt werden konnte, die Negativkontrollen aber durch die Eigenschaften der Reporterproteine nicht eindeutig negativ waren. Desweiteren zeigt sich eine hohe Ausbleichrate von BFP, ferner überlappt sich das Emissionsspektrum von BFP und GFP in einem grossen Bereich, sodass es unabhängig von einem möglichen FRET von BFP zum Auftreten einer entsprechenden Grünfluoreszenz aufgrund der Anregung durch die Lichtquelle kommen kann. Im zweiten Teil zeigt sich, dass die Produktion von YopE und SycE kontinuierlich stattfindet und mit dem Beginn der in vitro Stimulation produziert werden, mit einem Verhältnis deutlich zugunsten von SycE. Diese Ergebnisse sprechen für ein Modell der Chaperon-induzierten, posttranslationalen Sekretion von YopE. Gleichzeitig ist durch die hohe Stabilität von GFP die fluoreszenzmikoskopische Bestimmung der Produktionskinetiken von YopE-GFP und anderen Proteinen begrenzt.