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Schreyer, Magdalena (2011): Immunmodulatorische Wirkungen von gerinnungsaktiven Substanzen auf die LPS-induzierte Zytokinsynthese von Monozyten. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Blutgerinnung und Entzündung sind zwei stark miteinander verknüpfte Vorgänge im menschlichen Körper. Es ist gängige Meinung, dass während einer Sepsis die systemische Entzündung unweigerlich zu einer Aktivierung des Gerinnungssystems und einer gleichzeitigen Inhibition des blutgerinnungshemmenden Systems sowie der Fibrinolyse führt. Durch die massive Aktivierung der Gerinnung kommt es zu einer sogenannten Verbrauchskoagulopathie, bei der vor allem die antikoagulatorische Kapazität stark reduziert ist. So ist die Aktivität von ATIII und APC, zwei der wichtigsten körpereigenen Gerinnungsinhibitoren, während der Sepsis erheblich vermindert. Rekombinant hergestelltes APC hat als Xigris® seit 2002 die europäische Zulassung zur Behandlung der schweren Sepsis. In einer klinischen Studie der Phase 3 wurde eine Reduktion der 28-Tage Sterblichkeit durch die Gabe von APC bei Patienten mit schwerer Sepsis festgestellt. Im Gegensatz zu APC zeigte ATIII in einer Studie der Phase 3 an Patienten mit schwerer Sepsis keine Reduktion der 28-Tage Sterblichkeit. Es ist generell akzeptiert, dass das septische Mehrorganversagen durch die systemische Immunantwort des Organismus auf eine Infektion und die daraus resultierende überschießende systemische Freisetzung inflammatorischer Mediatoren vermittelt wird. Die Freisetzung dieser Mediatoren erfolgt unter anderem aus Monozyten. Durch den entzündlichen Stimulus während einer Verletzung oder Sepsis wird auf Monozyten neben der Freisetzung von Zytokinen auch TF induziert, der Rezeptor und Aktivator von FVII. Der Komplex aus TF und FVIIa stellt den Anfangspunkt der exogenen Gerinnung dar. Seit einigen Jahren wird rFVIIa als „rescue therapy“ zur Kontrolle schwerer traumatisch verursachter Hämorrhagien diskutiert. Dabei soll durch die Gabe von rFVIIa die Gerinnung spezifisch am Ort der Verletzung verstärkt werden. Da durch das Trauma und die damit verbundene Entzündungsreaktion Monozyten vermutlich TF exprimieren, stellen auch diese Zellen einen potentiellen Angriffspunkt für rFVIIa dar. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war, mögliche gerinnungsunabhängige immunmodulatorische Eigenschaften dieser, in der Intensivmedizin verwendeten, körpereigenen Substanzen zu untersuchen. Im Speziellen sollte die Auswirkung der Pro- bzw. Antikoagulantien auf die LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von Monozyten untersucht werden, ein wichtiger Bestandteil in der Entstehung von Sepsis und MODS. Dazu wurde ein Versuchsmodell mit einer humanen, monozytären Zelllinie, MonoMac6, etabliert. Die Produktion von IL-1β, IL-8 und TNFα wurde intrazellulär mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt. Im Zellkulturüberstand wurden die Konzentrationen von IL-1β, IL-8, IL-10 und TNFα mit einem Luminex-100 System gemessen. Zusätzlich wurde für rFVIIa der Einfluss auf die LPS-induzierte IL-1β-, IL-6-, IL-8- und TNFα-Synthese von CD14+ Monozyten in PBMCs durchflusszytometrisch erfasst. In der vorgelegten Arbeit konnte eine limitierende Wirkung von APC und ATIII auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten festgestellt werden. APC verminderte die IL-1β-, IL-10- und TNFα-Ausschüttung signifikant, wobei Überstandsmessungen die eindeutigsten Ergebnisse zeigten. Der Effekt von ATIII ließ sich durchflusszytometrisch besser bestimmen, als aus dem Überstand. Es zeigte sich eine signifikant verminderte LPS-induzierte IL-1β- und TNFα-Produktion der Monozyten. Zusätzlich wurde der Effekt von Heparin auf die ATIII-Wirkung untersucht, da es mehrere Hinweise auf eine negative Beeinflussung der ATIII-Therapie in der Sepsis durch gleichzeitige Gabe von Heparin gibt. In der vorgelegten Arbeit konnte interessanter Weise kein antagonisierender Effekt von Heparin auf die immunologische Wirkung von ATIII festgestellt werden. Neben dem positiven Effekt durch die Wiederherstellung der Antikoagulation während der Sepsis, kann APC auch zur Wiederherstellung des Gleichgewichts zwischen Pro- und Antiinflammation beitragen. APC vermindert sowohl die Synthese pro-, als auch die antiinflammatorisch wirkender Mediatoren, was eine Erklärung für die Wirksamkeit bei dem sehr heterogenen Kollektiv der Sepsispatienten sein könnte. ATIII reduziert nach unseren Ergebnissen lediglich die Synthese der proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β, nicht aber die von IL-10. Geht man davon aus, dass APC deshalb wirksam ist, weil es sowohl eine überschießende Pro- als auch Antiinflammation dämpfen kann, wäre das eine Erklärung für das Fehlen des klinischen Wirksamkeitsnachweises für ATIII bei Patienten mit schwerer Sepsis. Für rFVIIa ergab sich ein messbarer, aber nicht eindeutig charakterisierbarer immunmodulatorischer Effekt auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten. Bei MonoMac6 Zellen zeigte sich ein leicht begrenzender Effekt auf die IL-8- und TNFα-Produktion. Die Behandlung von PBMCs mit rFVIIa ergab keine veränderte LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von CD14+ Monozyten. In verschiedenen Versuchsabläufen wurden MonoMac6 Zellen zur Erhöhung der TF-Expression vor der Inkubation mit rFVIIa mit TNFα oder LPS behandelt. Dabei zeigte sich je nach Messmethode und Vorbehandlung außer einer geringen Steigerung der TNFα-Synthese LPS-vorbehandelter Monozyten kein Effekt. Zusätzlich wurde eine Transfektion der MonoMac6 Zellen mit TF durchgeführt. In Versuchen mit dieser Zelllinie ergab sich eine erhöhte TNFα-Synthese unter rFVIIa-Einfluss. Dieses Ergebnis ist jedoch mit Vorsicht zu betrachten, da die Reaktion der transfizierten Zellen auf LPS alleine im Kontrollexperiment nicht der des Wildtyps entsprach. Eine rFVIIa-induzierte Bildung von Thrombin kann ebenfalls in die Immunreaktion eingreifen, dies illustriert die in der vorgelegten Arbeit unter Thrombineinfluss gemessene, stark verminderte LPS-induzierte IL-10 Ausschüttung. Allerdings konnte der direkte immunmodulatorische Effekt von rFVIIa weder mit der Komplexbildung aus TF und rFVIIa noch mit der von rFVIIa vermittelten Produktion von Thrombin in Verbindung gebracht werden. Die immunmodulatorische Wirkung von rFVIIa auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten konnte mit den in der vorgelegten Arbeit verwendeten Modellen nicht abschließend geklärt werden und lässt noch viel Raum für weitere Untersuchungen. Transfektionsversuche mit anderen monozytären Zelllinien oder die Selektion von TF-exprimierenden Immunzellen aus kritisch kranken Patienten wären mögliche Versuchsansätze für die Zukunft. Auch ein geeigneter Stimulus zur Induktion von TF auf isolierten humanen Monozyten, der nicht gleichzeitig die Zytokinsynthese anregt, würde vielversprechende Möglichkeiten bieten.