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Doering, Irene (2010): Vergleichende Untersuchung zum Metabolismus von nano- und mikromolaren Konzentrationen des tabakspezifischen Nitrosamins NNK in humanen Leber- und Lungenmikrosomen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war es, die konzentrationsabhängige Metabolisierung des tabakspezifischen Nitrosamins 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK) in den Mikrosomen von Lunge und Leber des Menschen zu charakterisieren. Es wurden kommerziell erhältliche gepoolte Mikrosomen verwendet um vergleichbare Ergebnisse in den verschiedenen Ansätzen zu erzielen. Die Mikrosomen wurden bei einer Proteinkonzentration von 0,2 mg/mL 20 min mit [5-3H]-NNK inkubiert. Zur Bestimmung der Kinetik kamen je 16 Konzentrationen von 0,006 bis 499 µM zum Einsatz. Die Charakterisierung des NNK-Metabolismus mit spezifischen Hemmstoffen für Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme, α-Naphthoflavon (NF; CYP 1A1/2), 8-Methoxypsoralen (MOP; CYP 2A6/13), Chlorzoxazon (CZ; CYP 2E1) und Troleandomycin (TAO; CYP 3A4/5) alleine und in Kombination aller 4 Stoffe, erfolgte bei 46 nM und 49 µM NNK und Hemmstoffkonzentrationen von 1, 5, 10, 25 und 50 µM. Der Einfluss von Nicotin und seines Hauptmetaboliten Cotinin wurde bei den gleichen NNK-Konzentrationen mit einem 300- bzw. 3000-fachen Überschuss der Alkaloide geprüft. Art und Menge der entstandenen Metaboliten wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit on-line Radioaktivitätsdetektion ermittelt. Durch Einsatz eines neuen Detektors mit vier hintereinander liegenden Messzellen und integrierten Additionsverfahren gelang es die Nachweisgrenze gegenüber handelsüblichen Detektoren um den Faktor 10 zu senken. Die Zuordnung der Metaboliten erfolgte durch Co-Chromatographie von Referenzsubstanzen, die durch UV-Detektion bei 245 nm bestimmt wurden. In Humanlebermikrosomen wurden 5 NNK-Metaboliten nachgewiesen, das Reduktionsprodukt 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL), die Produkte der α-Methylenhydroxylierung von NNK und NNAL, 4-Oxo-4-(3-pyridyl)-butansäure (Ketosäure) und 4-Hydroxy-4-(3-pyridyl)-butansäure (Hydroxysäure), das Produkt der α-Methylhydroxylierung von NNK, 4-Hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) und das N-Oxidationsprodukt von NNK, das NNK-N-Oxid. Humane Lungenmikrosomen bildeten die gleichen Metaboliten außer HPB. Die Umsätze konnten für alle Metaboliten über den gesamten Konzentrationsbereich von 6 nM bis 500 µM einer Reaktionskinetik nach Michaelis-Menten angepasst werden. Bei Anpassung nur im niedrigen, nanomolaren Bereich ergaben sich für alle Metaboliten außer Ketosäure und HPB km- und Vmax-Werte, die um 2 bis 3 Größenordnungen niedriger lagen als die Werte, die für den gesamten Konzentrationsbereich erhalten wurden. Dabei änderte sich die katalytische Effizienz, der Quotient aus Vmax/km-Werten nur geringfügig. Die Hemmstoffe wirkten in Lebermikrosomen stärker als in Lungenmikrosomen. Bei keinem der Hemmversuche konnte jedoch selbst unter Verwendung der höchsten Konzentration eine vollständige Hemmung der NNK-Verstoffwechslung durch α-Hydroxylierung und N-Oxidation erzielt werden. Die CYP-Inhibitoren hatten erwartungsgemäß nur einen geringen Einfluss auf die NNK-Reduktion zu NNAL. In der Leber wurde die HPB-Bildung am stärksten gehemmt, gefolgt von der NNK-N-Oxidation, der Bildung von Ketosäure und der Bildung von Hydroxysäure. In Lungenmikrosomen war die Hemmung der NNK-N-Oxidation am stärksten ausgeprägt. Die größten Unterschiede zwischen der nano- und der mikromolaren NNK-Konzentration zeigte sich in Lebermikrosomen bei Einsatz von NF mit mäßiger bis starker Hemmung aller Stoffwechselwege bei 46 nM NNK und keiner Hemmung bis z.T. leichter Steigerung des Metabolismus bei 49 µM NNK. Auffällige Unterschiede auch bei TAO in Leber und Lunge und bei CZ in der Leber zeigen, dass sich Versuche mit bisher verwendeten hohen NNK-Konzentrationen nur bedingt auf niedrigere Konzentrationen übertragen lassen. Die in früheren Untersuchungen gezeigte Hemmung des NNK-Stoffwechsels konnte bei der mikromolaren NNK-Konzentration für die α-Hydroxylierung von NNK in Lungen- und Lebermikrosomen bestätigt werden. In der Leber wurde auch die NNK-N-Oxidation deutlich gehemmt. Überraschend war die Hemmung der Reduktion von NNK zu NNAL in Lungen- und Lebermikrosomen. All diese Effekte gingen bei Einsatz der nanomolaren NNK-Konzentration verloren. Es ist deshalb fraglich, ob unter realen Bedingungen bei Rauchern der NNK-Stoffwechsel durch die Tabakalkaloide beeinflusst wird. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass die bei Verwendung unrealistisch hoher Konzentrationen von Fremdstoffen in vitro erzielten Ergebnisse nicht ohne weiteres auf die tatsächliche Belastungssituation des Menschen durch Umwelt, Nahrung und Genuss von Tabakwaren zu übertragen sind.