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Hilgendorf, Annette (2003): Down-modulation of the apoptosis receptor Fas and the EGF receptor by the adenovirus E3/10.4-14.5K proteins requires the concerted action of two distinct transport signals. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Human adenoviruses (Ads) have evolved elaborate mechanisms to counteract the host’s antiviral immune response. The early transcription unit 3 (E3) of the virus is not essential for virus replication in vitro, but is known to encode proteins with immunomodulatory functions. The Ad2 E3/10.4-14.5K proteins are both integral membrane proteins, which form a physical complex and function together to modulate cell surface expression of the EGFR and selective members of the TNF/NGF receptor superfamily, namely Fas/CD95 and TRAIL-R1, whereas TRAIL-R2 modulation additionally requires E3/6.7K. In a process referred to as receptor down-regulation, 10.4-14.5K relocates receptor targets from the cell surface to lysosomes for degradation. The aim of this study was to characterize functional determinants within the Ad2 10.4-14.5K proteins, that are required for down-regulation of plasma membrane receptors. In particular, I focussed on the characterization of potential transport motifs present in the cytoplasmic tail of both proteins: The Ad2 14.5K tail contains three YXXF sequence motifs (Y denotes tyrosine, X any amino acid and F a bulky, hydrophobic residue) while the Ad2 10.4K sequence displays two consensus elements of the second large class of transport signals, the dileucine motifs. Both types of motifs are recognized by cellular adaptor proteins which select cargo for directed transport in clathrin-coated vesicles. FACS analysis of stable E3-transfectants expressing 10.4-14.5K mutant proteins revealed that residues contained within these putative transport motifs were essential for down-regulation of Fas and the EGFR in vivo. Receptor expression was restored when either the dileucine pair (LL87,88) of 10.4K or 14.5K Y74 or Y122 were replaced by alanine. Whereas loss of function of the 14.5K mutant Y74 can be explained by its inability to interact with 10.4K, several lines of evidence suggest that the 10.4K dileucine pair and 14.5 Y122XXF motif function as transport signals: (i) Surface plasmon resonance spectroscopy showed that mutation of the two motifs prevents binding of 10.4K and 14.5K cytoplasmic tail peptides to purified adaptor protein complexes AP-1 and AP-2 in vitro. (ii) FACS analysis demonstrated that mutation of these motifs strongly affects FLAG-14.5K cell surface expression. (iii) In line with the FACS data, immunofluorescence microscopy revealed that mutant 14.5Y122A accumulates together with 10.4K at the cell surface, suggesting that the Y122FNL motif normally directs internalization of 10.4-14.5K. (iv) Substitution of the 10.4K dileucine pair increased the transport of 10.4-14.5K into lysosomes, resulting in enhanced degradation of both 10.4K and 14.5K without significantly disrupting complex formation. (v) The accumulation of mutant 10.4-14.5K at the cell surface upon coexpression of 10.4LL/AA and 14.5Y122A suggests that the dileucine motif acts downstream of Y122 and fulfills a sorting function subsequent to endocytosis. Transfer of the mutations into Ad2 and infection of primary fibroblasts revealed a similar defect in trafficking of 10.4LL/AA and 14.5 Y122A mutant proteins. Moreover, in infected cells substitution of the 10.4K dileucine pair and 14.5K Y122 impaired down-regulation of Fas, EGFR and both TRAIL-R1 and TRAIL-R2, implying a general role of these sorting signals for the mechanism of receptor down-regulation. Thus, two distinct transport signals present in the different subunits of the 10.4-14.5K complex seem to act in concert to establish efficient down-regulation of receptor targets. Alanine replacement mutagenesis of several other strictly conserved amino acids in 14.5K and FACS analysis of stable E3-transfectants revealed that those mutants which exhibited an altered FLAG-14.5K surface expression had defects in Fas and EGFR down-modulation. Surprisingly, Ad4 was unable to modulate Fas and EGFR expression, even though the Ad4 14.5K protein contained all the strictly conserved amino acids. As a first step to identify structural features that determine target specificity of 10.4-14.5K, I chose to replace the 10.4-14.5K ORFs in Ad2 by their Ad4 homologues. Although the Ad4 10.4-14.5K proteins could be detected in Ad4-infected cells, their expression level was drastically reduced when encoded by the Ad2 E3 region. This indicated that expression of Ad4 10.4-14.5K is differently regulated as compared to Ad2, possibly due to altered splicing. Further exploration of this system will require a detailed analysis of splicing within the Ad4 E3 region

Abstract

Humane Adenoviren (Ad) besitzen ausgefeilte Mechanismen, um die Immunantwort des infizierten Wirtsorganismus zu umgehen. Die frühe Transkriptionseinheit 3 (early transcription unit E3) des Virusgenoms ist nicht essentiell für die Virusreplikation in vitro, jedoch ist bekannt, dass sie für immunmodulatorische Funktionen kodiert. Die Ad2 E3/10.4-14.5K Proteine sind beide integrale Transmembranproteine, die einen Komplex bilden und zusammenwirken, um die Zelloberflächenexpression des EGFR und ausgewählter Mitglieder der TNF/NGF Rezeptorfamilie zu modulieren, letzere sind Fas/CD95 und TRAIL-R1, hingegen erfordert die Modulation des TRAIL-R2 zusätzlich E3/6.7K. In einem Prozess, welcher als Rezeptor-Herunterregulierung („receptor down-regulation") bezeichnet wird, bewirkt 10.4-14.5K eine Umverteilung von Zielrezeptoren von der Zelloberfläche in ein lysosomales Proteinabbaukompartiment, gefolgt von lysosomalem Abbau der Rezeptormoleküle. Ein Ziel dieser Arbeit war es funktionelle Determinanten in den Ad2 10.4-14.5K Proteinen zu charakterisieren, die für den Prozess der „receptor down-regulation“ notwendig sind. Im Besonderen wurden in diesem Zusammenhang potentielle Transportmotive untersucht, die in den cytoplasmatischen Teilen beider Proteine vorliegen: In Ad2 14.5K finden sich drei YXXF Sequenzmotive (Y steht für Tyrosin, X irgendeine Aminosäure and F eine sperrige, hydrophobe Aminosäure), und in der Ad2 10.4K Sequenz sind zwei Konsensuselemente der zweiten großen Klasse bekannter Transportsignale, sogenannte Dileucinmotive. Beide Motivklassen werden von zellulären Adaptorproteinen erkannt, welche die Aufnahme und den gerichteten Transport von Membranproteinen in Clathrin-umhüllten Vesikeln regulieren. FACS-Analyse von stabilen E3-Transfektanten, die mutierte 10.4-14.5K Proteine exprimieren, zeigte, dass Aminosäuren in diesen potentiellen Transportmotiven in vivo essentiell für die Herunterregulierung von Fas und EGFR sind. Die Rezeptor-Zelloberflächenexpression war wiederhergestellt, wenn entweder das Dileucinpaar (LL87,88) in 10.4K oder 14.5K Y74 oder Y122 durch Alanin ersetzt wurden. Während der Funktionsverlust der 14.5K-Mutante Y74 dadurch erklärt werden kann, dass die Interaktion mit 10.4K gestört ist, weisen mehrere experimentelle Befunde darauf hin, dass das 10.4K Dileucinpaar and 14.5 Y122XXF-Motiv funktionelle Transportsignale darstellen: (i) Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie zeigte, dass durch Mutation dieser beiden Motive die Bindung von 10.4K und 14.5K Peptiden an gereinigte Adaptorproteinkomplexe AP-1 and AP-2 in vitro verhindert wird. (ii) FACS-analyse ergab, dass die Mutation dieser Motive zu drastischen Veränderungen der FLAG-14.5K Zelloberflächenexpression führt. (iii) Im Einklang mit den FACS-daten konnte durch Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass die Mutante 14.5Y122A zusammen mit 10.4K an der Zelloberfläche akkumuliert, was darauf hindeutet, dass das Y122FNL Motiv normalerweise die Internalisierung von 10.4-14.5K steuert. (iv) Substitution des 10.4K Dileucinpaares erhöhte den Transport von 10.4-14.5K in Lysosomen, welches zu einem verstärkten Abbau beider Proteine, 10.4K und 14.5K, führte, jedoch ohne deren Komplexbildung signifikant zu beeinträchtigen. (v) Die Akkumulation von mutantem 10.4-14.5K an der Plasmamembran bei Coexpression von 10.4LL/AA and 14.5Y122A läßt vermuten, dass das Dileucinmotif nachgeschaltet zu Y122, d.h. als Transportsignal nach der Endozytose wirkt. Übertragung der Mutationen in das Ad2-Genom und Infektion primärer Fibroblasten ergab einen ähnlichen Defekt im Transport von 10.4LL/AA und 14.5 Y122A Proteinen. Darüberhinaus wurde durch Substitution des 10.4K Dileucinpaares oder 14.5K Y122 in infizierten Zellen die Herunterregulierung von Fas, EGFR und auch TRAIL-R1 and TRAIL-R2 beeinträchtigt, was darauf schließen lässt, dass diese Transportsignale von genereller Bedeutung für den Mechanismus der Rezeptor-Herunterregulierung sind. Dies lässt als Schlussfolgerung zu, dass zwei unterschiedliche Transportsignale in den verschiedenen Untereinheiten des 10.4-14.5K Komplexes zusammenwirken, um eine effiziente Rezeptor-Herunterregulierung zu bewerkstelligen. Alaninaustauschmutagenese mehrerer anderer strikt konservierter Aminosäuren in 14.5K und FACS-analyse von stabilen E3-Transfektanten zeigte, dass jene Mutanten, die eine Veränderung der FLAG-14.5K Oberflächenexpression aufwiesen, einen Defekt in der Modulation der Oberflächenexpression von Fas und EGFR hatten. Überraschenderweise ruft Ad4-infektion keine Modulation von Fas und EGFR Zelloberflächenexpression hervor, obwohl das Ad4 14.5K Protein all die strikt konservierten Aminosäuren enthält. Als ersten Schritt zur Identifizierung struktureller Unterschiede, die die Zielrezeptor-spezifität von 10.4-14.5K bedingen, entschloss ich mich die 10.4-14.5K ORFs in Ad2 durch ihre Ad4-Homologen zu ersetzen. Obwohl die Ad4 10.4-14.5K Proteine in Ad4-infizierten Zellen detekiert werden konnten, war ihr Expressionslevel stark reduziert im Falle einer Kodierung durch die Ad2 E3 Region. Dies wies daraufhin, dass die Expression von Ad4 10.4-14.5K andersartig reguliert ist als in Ad2, möglicherweise aufgrund andersartigem RNA-Spleißen. Weitere Untersuchungen erfordern eine detaillierte Analyse des Spleißens in der Ad4 E3 region.