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Concia, Massimo (2010): Fluorescence labeled PEI-based gene delivery systems for near infrared imaging in nude mice. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Gene therapy is a research area where nucleic acids are transferred into cells to treat neoplastic, metabolic and hereditary diseases. Delivery of genetic material into living organisms can be achieved with viral or non-viral vectors. Viral gene carriers are very efficient but present some major disadvantages due to their pathogenicity and immunogenicity. Nonviral carriers are based on synthetic molecules binding and condensing nucleic acids into small, virus-like particles. The aim of this thesis was to study the biodistribution and tumor targeting properties of non-viral gene vectors based on polyethylenimine (PEI) after systemic injection into mice. The gene vectors were labeled with fluorescent dyes emitting in the near infrared (NIR), which allowed studying their bio-distribution in living animal over time. Owing to its amine groups PEI has a high positive charge density that enables electrostatic interactions with negatively charged nucleic acids and their efficient compaction into nucleic acid-PEI complexes, called polyplexes. The net positive surface charge of these polyplexes permits interactions with negatively charged cell surface molecules, thus leading to their internalization into the cell. To avoid unspecific interactions with blood components and nontarget tissues after intravenous application, polyplexes were shielded with the hydrophilic molecule polyethylene glycol (PEG). PEI-based gene carrier systems were tested on two subcutaneously implanted tumor types: Human Hepatocellular Carcinoma (HUH7) and Murine Neuroblastoma (N2a). HUH7 cells express epidermal growth factor (EGF) receptors, while N2a cells express transferrin (Tf) receptors on their surfaces. To enable targeting of the polyplexes to the tumor cells, polyplexes were generated containing the ligands EGF and Tf for targeting of HUH7 cells and N2a cells respectively. The targeted polyplexes were then intravenously injected into immunodeficient, athymic nu/nu mice in which HUH7 or N2a tumor cells had been previously set under their skin. To monitor the biodistribution of polyplexes throughout the mouse organism and to evaluate their gene delivery capability into the neoplastic cells, polyplexes were labeled with fluorescent dyes (Alexa 750, NIR 797) or near infrared emitting quantum dots (QD), whose fluorescent expression signal was detected and analyzed with a device for imaging in vivo. All fluorescent molecules and quantum dots were biocompatible and non-toxic. They emitted light in the near infrared area of the spectrum, thus avoiding overlapping phenomena with autofluorescent biomolecules or absorption of light by hemoglobin. With all dyes used for polyplex labeling a fluorescent signal could be observed in organs like liver and lung being clearly distinguishable from background fluorescence. Among the fluorescent molecules tested, quantum dots were identified being the most suitable method for in vivo studies, showing the highest signal/noise ratios. PEG-shielding led to best tumor targeting efficiency when administering EGF or Tf-targeted polypelxes in mice bearing HUH7 and N2a tumors respectively. A clear fluorescent signal specific for tumor tissue was detected; the imaging software used allowed quantitative analysis of this signal. For this reason this system is now available for further experimental applications.

Abstract

Gentherapie befasst sich mit der Insertion von Nukleinsäuren in Zellen, um neoplastische, metabolische sowie hereditäre Krankheiten zu behandeln. Der Transfer von genetischem Material in einen lebenden Organismus kann durch die Verwendung viraler oder nicht viraler Vektoren erfolgen. Viren sind zwar sehr effektiv, aber ihre Anwendung birgt auch Probleme, die meist durch ihre Pathogenität und Immunogenität bedingt sind. Nicht virale Vektoren sind synthetische Moleküle, die Nukleinsäuren in kleine, virusähnliche Partikeln einbinden und kondensieren. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es die Bioverteilung und die gezielt gegen den Tumor gerichteten Eigenschaften von Genvektoren, die auf Polyethylenimin (PEI) basieren, nach intravenöser Injektion in Mäusen zu untersuchen. Die Genvektoren wurden mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert, die Licht innerhalb des Nahinfrarot-Bereiches (NIR) emittieren und im Zeitverlauf die Beobachtung der Bioverteilung in lebenden Tieren erlauben. Dank seiner Aminogruppen hat PEI eine stark positive Ladung, die gute elektrostatische Bindungen zu negativ geladenen Nukleinsäuren erlaubt, mit denen es zum Aufbau eines Nukleinsäure-PEI-Komplexes führt, der Polyplex genannt wird. Die positiv geladene Oberfläche von PEI ermöglicht auch Interaktionen mit negativ geladenen Zellenoberflächen mit der Folge einer Internalisierung des Komplexes. Um unspezifische Interaktionen mit Blutbestandteilen oder anderen als dem Zielgewebe zu verhindern, wurden die Polyplexe mit dem hydrophilen Molekül Polyethylenglycol (PEG) umhüllt. Diese auf PEI-Basis synthetisierten Gencarrier-Systeme wurden dann an der humanen Leberzell Karzinom Linie HUH7 und der Maus Neuroblastom Linie N2a getestet. Die HUH7-Zellinie exprimiert Rezeptoren für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und die N2a-Zelllinie Rezeptoren für Transferrin (Tf) auf ihrer Oberfläche. Um ein gezieltes Tumor-Targeting von HUH7- oder N2a-Zellen zu ermöglichen, wurden Polyplexe erstellt, die EGF bzw. Transferrin an ihrer Oberfläche enthalten. Diese oberflächlich modifizierten Komplexe wurden dann intravenös in athymische nu/nu Mäuse verabreicht, die vorher HUH7- oder N2a-Zellen subkutan implantiert bekommen hatten. Um die Verteilung der Polyplexe als experimentelle genetische Medikamente innerhalb des murinen Organismus zu beobachten und die Akkumulation im Tumorgewebe auszumessen, waren sie mit fluoreszierenden Farbstoffen(Alexa 750, NIR 797) oder im Nahinfraroten emittierenden Quantum Dots (QD) markiert, deren Fluoreszenzsignalexpression mittels eines Messungsgerät für in vivo Analysen analysiert wurde. Alle fluoreszierenden Moleküle und Quantum Dots zeigten sich biokompatibel und nicht toxisch und emittierten Licht innerhalb des nahinfraroten Bereichs des Spektrums. Damit konnte die Lichtabsorption durch Hämoglobin ebenso vermieden werden, wie sämtliche Überschneidungsphänomene mit der Fluoreszenz anderer Biomoleküle. Bei allen für die Markierung von Polyplexen verwendeten Farbstoffen und den Quantum Dots wurde ein fluoreszierendes Signal in Organen wie Leber und Lunge beobachtet, das eindeutig von der Hintergrundfluoreszenz unterschieden werden konnte. Unter den getesteten fluoreszierenden Substanzen konnten Quantum Dots als beste Methode für die Fluoreszenzmarkierung festgelegt werden. Hier war das Signal am deutlichsten von störender Hintergrundstrahlung zu unterscheiden. Das PEG-Shielding erlaubte die höchste Effizienz im Tumor-Targeting vor allem bei Applikation von EGF- bzw. Tfmarkierten Polyplexen in Mäusen, die HUH7- bzw. den N2a-Tumor trugen. Ein ausgeprägtes und für Tumorgewebe spezifisches Signal konnte hier beobachtet werden. Die verwendete Imaging-Software für in vivo Applikationen ermöglichte eine quantitative Signalanalyse. Damit steht dieses System für weitere experimentelle Anwendungen zur Verfügung.