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Gao, Jinliang (2009): Molecular characterization of the fibronectin-binding protein BBK32 of Borrelia burgdorferi sensu lato. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

BBK32, a fibronectin (Fn)-binding protein of Borrelia (B.) burgdorferi sensu lato (s.l.) which is encoded by the bbk32 gene located on the 36kb linear plasmid (lp36) of isolate B31, is playing an important role in serological diagnosis of Lyme borreliosis. Firstly, we were interested in the genomic localization of bbk32 regarding different B. burgdorferi s.l. species as well as between strains of the same species. Southern blot analyses based on 23 strains of the species B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. afzelii, B. garinii and B. spielmanii revealed that position of bbk32 is rather variable between the species but also within a given species. bbk32 could be located on different linear plasmids (lp), mainly on lp23kb, lp24kb, lp25kb, lp31kb and lp36kb. The meaning of this finding remains unclear so far. Secondly, a mumber of thirteen chimeric polypeptides representing different parts of the N-terminal regions of BBK32 proteins of both B. burgdorferi s.s. isolate B31 and B. garinii isolate PHei were generated. Fn-binding capabilities of those generated polypeptides were evaluated either by Western-ligand blot-based binding assay or by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based binding assay. Results showed that BBK32 from PHei possesses a higher Fn-binding capability than that from B31. Furthermore, the higher Fn-binding capacity is associated with four amino acids (Lysine131, Lysine145, Threonine147 and Isoleucine155) in the 32-amino acid-long segment (from position 131 to 162). Moreover, both gelatin and collagen could partially inhibit the binding of BBK32 to Fn. This suggests that BBK32 might also bind to the collagen-binding domain of Fn (repeat I6-9 and II1, 2) and partially to its N-terminal fibrin-binding domain (repeat I1-5). Though the meaning of the different Fn-binding capacities remains unclear so far, such studies may provide us with markers to define the different pathogenic potentials of various Borrelia species and strains. Thirdly, eight recombinantly prepared BBK32 homologues (either as partial or as whole) were tested in a line assay to evaluate their contribution for serologic diagnosis of Lyme borreliosis. Though BBK32 homologues could react with sera from Lyme borreliosis patients, compared with other Borrelia-antigens established in the Max von Pettenkofer Institute, these BBK32 homologues could not improve the sensitivity and specificity of the class-specific IgG or IgM antibody tests. Nevertheless, this study underlines the fact that the heterogeneity of Lyme disease Borrelia species must be taken into consideration in the microbiological diagnosis of Lyme borreliosis in European patients.

Abstract

BBK32 ist ein Fibronectin (Fn)-bindendes Protein des Bakteriums Borrelia (B.) burgdorferi sensu lato (s.l.). BBK32 wird durch das bbk32-Gen, das im 36 kb linearen Plasmid (lp36) des Isolates B31 liegt, kodiert und spielt eine wichtige Rolle in serologischen Verfahren für den Nachweis von Lyme Borreliosis. Als erstes waren wir an der Lokalisierung von bbk32-Gen in verschiedenen B. burgdorferi s.l. Spezies sowie in verschiedenen Stämmen derselben Spezi interessiert. Southern-Blot-Analysen von 23 Stämmen der Spezies B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. afzelii, B. garinii und B. spielmanii zeigten unterschiedliche Lokalisation des bbk32-Gens sowohl in den verschiedenen Spezies, als auch in verschiedenen Stämmen derselben Spezi. Das bbk32-Gen konnte in verschiedenen linearen Plasmiden (lp), hauptsächlich in lp23kb, lp24kb, lp25kb, lp31kb und lp36kb, lokalisiert werden. Die Relevanz dieser unterschiedlichen Lokalisierung ist nicht klar. Zweitens, es wurden 30 chimäre Polypeptid-Sequenzen aus unterschiedlichen Bereichen der N-terminalen Region des BBK32-Proteins von B. burgdorferi s.s. Isolat B31 und B. garinii Isolat PHei generiert. Die Fn-Bindungsfähigkeit dieser hergestellten Polypeptide wurde entweder mittels eines Western-Ligand Blot-basiertes Bindungstestes oder eines Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA)-basiertes Bindungstestes evaluiert. Die Ergebnisse zeigten, dass BBK32 aus PHei ein höheres Fn-Bindungspotenzial als BBK32-Polypetide aus B31 aufweist. Außerdem ist die höhere Fn-Bindungsfähigkeit mit dem Vorhandensein der vier Aminosäuren: Lysin131, Lysin145, Threonin147 und Isoleucin155 im 32-Aminosäuren langen Segment (von Aminosäure-Position 131 bis 162) assoziiert. Darüber hinaus konnten sowohl Kollagen als auch Gelatine die Bindungsfähigkeit von BBK32 an Fn teilweise inhibieren. Dies deutet darauf hin, dass BBK32 vielleicht auch an Kollagen-Bindungsdomäne in Fn (Motive I6-9 and II1, 2) und teilweise an der N-terminalen Fibrin-Bindungsdomäne (Motive I1-5) binden könnte. Obwohl die Bedeutung der unterschiedlichen Bindungsfähigkeit an Fibronectin noch unklar ist, diese Studie könnte Marker zur Identifizierung diverser Borrelia-Spezies und –Stämme mit unterschiedlichem Pathogenitätspotenzial liefern. Drittens, acht rekombinant hergestellte homologe BBK32-Proteine (gesamte oder nur Teil-Sequenzen des Proteins) wurden für ihre mögliche Verwendung für serologische Verfahren zum Nachweis von Lyme Borreliosis in einem Linientest geprüft. Obwohl BBK32-Homologe mit Seren aus Patienten mit Lyme Borreliosis reagierten, konnten diese, gegenüber anderen im Max von Pettenkofer-Institut etablierten Borrelien-Antigene, zu keiner Erhöhung der Sensitivität und Spezifität des klassenspezifischen Nachweises von IgG oder IgM im Antikörper-Test führen. Nichtsdestoweniger unterstreicht diese Arbeit die Tatsache, dass die Heterogenität der Borrelien-Spezies bei der mikrobiologischen Diagnose von Lyme Borreliosis in Betracht gezogen werden muss.